[发明专利]一种增强淋巴细胞靶向杀伤肿瘤的活性因子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型生物活性因子(dsNKG2D-IL-15即双可溶性NK细胞活化性受体NKG2D与细胞因子IL-15)融合蛋白的构建和制备：基于利用肿瘤细胞自身结合、富集、并反式递呈该活性蛋白，不仅直接激活其局部微环境内的NK或细胞毒性T细胞(CTL)，并有望增强体内的特异性免疫应答，将可用于肿瘤的治疗，属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤细胞降低HLA I类分子及共刺激分子的表达，逃逸机体内T淋巴细胞的监视，却激活了NK细胞的活性。如果NK细胞表面活化性受体传递的活化性信号强于抑制性受体传递的抑制性信号，NK细胞将被活化，分泌细胞因子及直接杀伤肿瘤细胞，被誉为是机体抗肿瘤的第一道防线。另一方面，肿瘤逃逸NK细胞监视功能的事实以及大量实验依据证明，肿瘤组织内NK细胞的数目及功能均低于正常组织。因此，如何在体内或体外促进NK细胞增殖、并提高NK细胞的生物学活性，决定以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗的效果。

NK细胞主要通过下面四条识别途径而活化：1)非己识别，表现为通过模式识别受体识别一些病原相关的分子模式而被活化。2)应激诱导的识别，即识别肿瘤细胞或病毒感染细胞表面的应激分子，如MICA或ULBP蛋白等，与活化性受体NKg2D结合而激活NK细胞。3)缺失自我的识别，表现为肿瘤细胞或病毒感染的细胞丢失或下调了经典HLAI类分子的表达，引起抑制性信号减弱而使NK细胞活化。4)细胞因子介导的活化，也是NK细胞活化的最有效刺激剂，例如DC细胞来源的IL-15是促进NK细胞增殖、活化及发挥细胞毒效应的关键细胞因子；IL-12是促进NK细胞分泌IFN-γ最有效的细胞因子；而IL-18可能促进NK细胞向淋巴结或脾脏内迁移，并与DC相互作用。

IL-15被誉为是NK细胞的生长因子，也是NK细胞发育分化过程中的关键细胞因子。IL-15与IL-2空间结构相似，含有4个α螺旋，分子量14～15KD。IL-15除其特异性α受体外，与IL-2共有β受体，与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21共有γ受体。与IL-2相比，IL-15可有效延长NK细胞生命周期，促进记忆性CD8⁺T细胞在体内的长期存活，维持免疫记忆。虽然IL-2已被FDA批准用于转移性肾癌和恶性黑色素瘤的治疗，但IL-2诱导肿瘤抗原限制性T细胞凋亡的特点会降低其抗肿瘤效应。另外IL-2具有抑制记忆性T细胞存活、维持CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的特点，提示用IL-15代替IL-2用于肿瘤治疗，将产生更好的效果。

IL-15及IL-15Rα基因敲除小鼠实验证明IL-15主要被细胞反式递呈而发挥效应，即IL-15被树突状细胞或其他基质细胞分泌后，立即与这些细胞表面的受体α结合(Ka＝10^-11)，再激活表达β与γ受体的邻近细胞(如NK细胞，CD8+T细胞)。而且Lucas等制备可诱导性清除体内CD11c^high DC的小鼠模型，发现淋巴结或脾脏内的DC细胞反式递呈IL-15，是引起NK细胞致敏(细胞浆内储备颗粒酶和干扰素)的必要因素。另外，Kobayashi等将IL-15Rα转染小鼠高转移性结肠腺癌细胞株MC38，移植普通小鼠可抑制肿瘤转移，而移植IL-15基因敲除鼠，短时间内肿瘤转移到肺组织导致小鼠死亡。这些现象提示若建立肿瘤细胞反式递呈IL-15的作用方式，NK细胞不仅高效扩增与活化，还具备靶向抗肿瘤的特点。

若要肿瘤细胞反式递呈IL-15，首要方法是给肿瘤细胞转染IL-15Rα，但如何让体内肿瘤细胞特异性摄取外源性的基因载体，目前的技术手段仍然困难。另一种较为简便的策略是制备某种融合蛋白，既使其氨基端与肿瘤细胞特异性结合，又在羧基端携带IL-15分子，从而具备激活NK细胞的效应。因此，选择合适的在肿瘤细胞与IL-15之间“搭桥”的分子非常关键，既可制备某一肿瘤抗原的单克隆抗体，也可以选取该抗原分子的受体。