[发明专利]改腺载体及其在艾滋病预防和治疗药物中的应用

权利要求书

1.冯氏载体，由包含以下步骤的方法制备：

A确定CCR5基因和CXCR4基因的修饰位点；

B确定能够识别选定的脱氧核糖核酸序列的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些氨基酸序列编进锌指核酸酶的编码筐，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物；

C把带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物克隆到腺卫星病毒II克隆质粒中，产生冯氏质粒；

D用pAAV-RC质粒或pHelper质粒和冯氏质粒来共同转染HEK293细胞，得到新的病毒载体即冯氏载体；

E冯氏载体的纯化；

F冯氏载体浓缩。

2.根据权利要求1所述的冯氏载体的制备方法，其特征是：

CCR5基因修饰位点为：

263 aCTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTg 289

263 tGATACGACGGCGGGTCACCCTGAAAc 289

CXCR4基因修饰位点为：

427 aacagtcagaggccaaggaagctgttg 453

427 ttgtcagtctccggttccttcgacaac 453。

3.根据权利要求1所述的冯氏载体的制备方法，其特征是：步骤B包括下列过程：

1)选定能够识别CCR5基因和CXCR4基因的的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些序列插入到相应的锌指核酸酶编码筐当中；

2)为锌指核酸酶的区段设计脱氧核糖核酸编码序列；

3)合成带有锌指核酸酶编码序列的低聚核苷酸；

4)用3)合成的低聚核苷酸作为引物进行聚合酶链反应，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的产物。

4.根据权利要求3所述的冯氏载体的制备方法，其特征是：为锌指核酸酶的区段设计的脱氧核糖核酸编码序列为：

识别CCR5基因锌指核酸酶结合区编码序列为

Cggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacttct

M  E  P  Y  A  C  P  V  E  S  C  D  R  R  F  S  T  S

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G  N  L  V  R  H  I  R  I  H  T  G  Q  K  P  F  Q  C  R  I

tgcatgcgtaacttcagtcgcaccgataccttacgcgatcatatacgaacacatacaggt

C  M  R  N  F  S  R  T  D  T  L  R  D  H  I  R  T  H  T  G

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E  K  P  F  A  C  D  I C  G  R  K  F  S  R  T  D  T  L  R

Gatcataccaaaatccatttaagacagaagcaaagctt

D  H  T  K  I  H  L  R  Q  K  Q  S    ，

识别CXCR4基因锌指核酸酶结合区编码序列为

cggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacatcg

M  E  P  Y  A  C  P  V  E  S  C  D  R  R  F  S   T  S

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G  A  L  T  R    H  I  R  I  H  T  G  Q  K  P  F  Q  C  R  I

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C  M  R  N  F  S   Q  S  S  D  L  T   R  H  I  R  T  H  T  G

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E  K  P  F  A  C  D  I  C  G  R  K  F  S  Q  S  G  N  L  A

cgacataccaaaatccatttaagacagaagcaaagctt

R  H  T  K  I  H  L  R  Q  K  Q  S