[发明专利]改腺载体及其在艾滋病预防和治疗药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及治疗艾滋病(AIDS)的基因药物，具体是冯氏载体——一种腺卫星病毒载体。 

背景技术

艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficency virus，HIV)感染而引起的传染性疾病，近20年来艾滋病在全球呈迅速蔓延趋势。到目前为止，还没有非常有效的治疗艾滋病的药物，因而寻找预防和治疗艾滋病药物的研究显得日益迫切。中国的人体免疫缺损病毒HIV/艾滋病AIDS扩散传染已经变得严重了。其发展已经历了两个过程(‘登录’，1985-88‘散布’1989-94)，目前发展到了第三阶段‘扩张’。据联合国估计，2010年大约有1千万中国人感染艾滋病病毒。 

据初步推测，感染艾滋病毒进入人体有两种机制：有些病毒直接融入细胞膜，有些病毒则由受体导入细胞。在1986年所做的一项研究清楚表明，艾滋病病毒感染的发生是由于与细胞表面T4的分子与病毒分子相互作用的直接结果。T4基因测序后，接着发现了这个现象。 

HIV病毒进入人体常作用于某些靶细胞，这是因为在细胞上，病毒壳与细胞膜边沿蛋白质之间的结合功能。在辅助细胞表面发现的蛋白质，即CD4，是艾滋病毒的受体蛋白质。CD4本身不足以诱发艾滋病毒的结合，但已证明艾滋病毒的结合机制中，CD4是必不可少的。已经发现，CD4，以及人趋化因子受体5(CCR5)或人趋化因子受体4(CXCR4)都是病毒结合所必需的物质。人体T细胞是白细胞之一。最重要的用于抗艾滋病毒的T细胞叫“CD4T细胞”。CCR5蛋白作用于普通HIV感染者以进入感染的T细胞。有些人的T细胞先天缺乏CCR5。这些人能抵抗艾滋病感染。一些人的T细胞只有少量CCR5，他们感染艾滋病后的发病状态要轻得多。因此，只要去除T细胞内的CCR5，就能治疗艾滋病。 

锌指核酸酶(ZFN)是一工程化的DNA结合蛋白质的集合体，在基因特定的部位造成DNA的双链断裂，以对其基因作修饰。每个锌指核酸酶(ZFN)由两个功能区组成：1)DNA结合区，由两指模块链组成，每个都是独特的六聚体(6bp)DNA序列。两指模块连在一起形成锌指蛋白，每个的特化≥24碱基对(bp)。2)DNA裂解区，由FokI的核酸区组成。当DNA结合区和DNA裂解区融合在一起时，产生一种高度特化的基因剪刀组合。ZEN可用于诱导特定DBA序列的双链断裂，从而促进特定部位的同源重组和各种不同形式细胞的基因位点的靶定操作。双链断裂对于特定位置的基因突变非常重要，因其刺激了细胞的自然DNA修复过程，此过程称为同源重组及非同源末端连接(NHEJ)。经过已建立的区域验证法，此一过程被用于精确产生靶定的基因编辑，从而产生靶定基因删除，重组，修饰后的细胞株。 

腺卫星病毒(AAV2)是相当小的DNA病毒，但却综合了反转录病毒会嵌入宿主染色体的特性，及腺病毒载体会感染不分裂的细胞的特性，而成为目前遗传性疾病基因疗法的新宠。在使用这个病毒载体时，基本上病毒本身的蛋白基因部份均已被剔除，故在宿主内也不会造成强烈的免疫反应，而可维持较长时段的基因表现。而先前制备该病毒之步骤较繁琐，且病毒力价偏低，目前也已一一克服，其力价也可高达10¹⁰～10¹³cfu/mL，故非常适合用于活体内。 

发明内容

本发明的目的是提供一种改造过的腺卫星病毒载体——冯氏载体，是在腺卫星病毒载体(AAV2病毒载体)的基础上改造而成，主要用于治疗艾滋病。它能表达两种锌指核酸酶，其中一种能专一性的修改艾滋病毒辅助受体CCR5基因，另一种能专一性的修改艾滋病毒辅助受体CXCR4基因。它的其它各方面与典型的腺卫星病毒载体无异。 

冯氏载体，由包含以下步骤的方法制备： 

A确定CCR5基因和CXCR4基因的修饰位点； 

B确定能够识别选定的脱氧核糖核酸序列的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些氨基酸序列编进锌指核酸酶的编码筐，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物； 

C把带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物克隆到腺卫星病毒II克隆质粒中，产生冯氏质粒； 

D用pAAV-RC质粒、pHelper质粒和冯氏质粒来共同转染HEK293细胞，得到新的病毒载体即冯氏载体； 

E冯氏载体的纯化； 

F冯氏载体浓缩。