[发明专利]辅助底物耦联提高重组菌不对称转化(R)-苯基乙二醇效率的方法

权利要求书

1.一种利用重组菌CCTCC NO：M 209289不对称转化制备(R)-苯基乙二醇效率的方法，其特征在于以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应：在0.1 mol/L、pH 8.0~9.0的Tris-HCl缓冲液中，底物2-羟基苯乙酮浓度为5~10 mg/mL，添加占反应体系总质量6%~10%的甘油和/或6%~10%的异丙醇，然后：

釆用重组菌全细胞生物转化：添加重组菌CCTCC NO：M 209289细胞浓度为0.1 g/mL，混匀后于30℃反应1.5-48 h，反应过程中不需要加入辅酶，产物为(R)-苯基乙二醇；

或釆用重组菌CCTCC NO：M 209289的细胞破碎后经纯化后的重组蛋白生物转化：重组蛋白浓度为1~2 μg/mL，再加5 mmol/L辅酶NADH，混匀后于30℃反应8 h，产物中(R)-苯基乙二醇纯度达80%以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于重组菌CCTCC NO：M 209289的培养

LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，用去离子水配制，pH 7.0；固体培养基再添加占培养基总质量1.5%的琼脂粉；

培养条件：挑取重组菌株CCTCC NO：M209289的单菌落接种于4 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养过夜，取1 mL培养液转接于100 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，温度转为30℃诱导培养过夜，8,000 g离心10 min，用生理盐水对沉淀所得菌体洗涤2次，收集重组菌细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于重组蛋白的纯化：

菌体收集：将收集的重组菌细胞用MCAC-0缓冲液重悬，300 W超声破碎：工作时间4 s，间歇时间 6 s，共20 min；破碎液16,000 rpm 离心40 min；弃沉淀，取上清进行后续的蛋白纯化工作；

蛋白纯化：先将上清挂Pharmacia公司的Ni柱两遍，用MCAC-50缓冲液洗脱杂蛋白，用MCAC-200缓冲液洗脱目的蛋白；再用Pharmacia公司的Hitrap柱进行蛋白脱盐：利用Pharmacia公司的??KTA 蛋白纯化系统将蛋白溶液换为无盐的缓冲液；接着用Pharmacia公司的Resource Q阴离子交换柱，1×1 cm，进行蛋白纯化；最后用Pharmacia公司的Superdex 200，HiLoad 26/60，进行蛋白纯化；经SDS-PAGE检测目的蛋白纯度达到90％以上。