[发明专利]辅助底物耦联提高重组菌不对称转化(R)-苯基乙二醇效率的方法

说明书

技术领域

辅助底物耦联提高重组菌不对称转化(R)-苯基乙二醇效率的方法，本发明通过构建底物耦联再生辅酶体系，大幅度提高重组菌全细胞不对称转化效率，即在反应体系中添加辅助底物甘油和/或异丙醇，一方面提高底物的溶解度，另一方面实现辅酶NADH的再生循环，高效制备(R)-苯基乙二醇，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

手性化合物在医药、农药和食品添加剂等行业得到了越来越广泛的应用。由于不同对映体在药理、毒理及功能作用等方面均有所不同，因此光学纯手性化合物的制备已成为当今生物催化领域的研究热点。

光学纯(R)-苯基乙二醇作为一种重要的手性模块化合物，广泛应用于医药、农药和化工材料等领域。为了满足市场的需求，以立体选择性氧化还原酶为目标酶，采用基因工程技术，以重组细胞为生物催化剂，不对称还原潜手性酮制备光学手性醇，已成为当今工业领域生产手性醇的主要发展趋势。

然而，氧化还原酶催化反应过程中，需要辅酶作为电子传递体参与反应，辅酶的不可再生循环是其工业应用的主要限制因子。虽然全细胞系统自身能提供一定数量的辅酶，但随着反应的进行，或底物浓度的提高，辅酶的供给速度远远低于消耗速率，造成催化持续性和稳定性下降，最终导致催化效率的降低。

辅酶再生循环的方法有多种，其中辅助底物耦联法，即在反应体系中直接添加醇类或糖类等辅助底物促进辅酶再生循环，是最简便的方法之一。本实验室已经利用重组菌株催化不对称转化制备(R)-苯基乙二醇，在此基础上，通过添加一定比例的辅助底物甘油和/或异丙醇，这些辅助底物被细胞内其他氧化还原酶系催化，产生所需的辅酶NADH，与(R)-羰基还原酶催化反应相耦联，加速辅酶NAD(H)的再生循环，促进不对称转化反应的持续进行，提高全细胞生物制备(R)-苯基乙二醇的效率。

发明内容

（1）要解决的技术问题

本发明的目的是构建底物耦联再生辅酶体系，利用经mRNA二级结构优化后的重组菌株CCTCC NO：M 209289 (中国专利200910263146.4已公开)作为催化剂，高效制备(R)-苯基乙二醇的方法。本发明目的在于解决氧化还原酶工业催化反应中辅酶再生的瓶颈问题，即在反应体系中通过添加一些廉价的辅助底物（8%甘油及10%异丙醇），较好地促进辅酶再生循环，使得反应底物的浓度提高了一倍（由原始的5 g/L提高到10 g/L），大大缩短了反应的时间（由原始的48 h缩短为1.5 h），提高了(R)-苯基乙二醇的转化效率（产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度达100% e.e.，产率为85.5%），为工业上高效、低成本制备光学纯(R)-苯基乙二醇奠定了坚实的基础。

（2）技术方案

所用一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为Escherichia coli BL21/pET32a-mrcr，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 209289，中国专利200910263146.4已公开。

一种利用重组菌CCTCC NO：M 209289不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应：在0.1 mol/L、pH 8.0~9.0的Tris-HCl缓冲液中，底物2-羟基苯乙酮浓度为5~10 mg/mL，添加占反应体系总质量6%~10%的甘油和/或6%~10%的异丙醇，釆用重组菌全细胞生物转化：添加重组菌CCTCC NO：M 209289细胞浓度为0.1 g/mL，混匀后于30℃反应1.5-48 h，反应过程中不需要加入辅酶，产物为(R)-苯基乙二醇；

或釆用重组菌CCTCC NO：M 209289的细胞破碎后经纯化后的重组蛋白生物转化：重组蛋白浓度为1~2 μg/mL，再加5 mmol/L辅酶NADH，混匀后于30℃反应8 h，产物中(R)-苯基乙二醇纯度达80%以上。

所述重组菌CCTCC NO：M 209289的培养，

LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，用去离子水配制，pH 7.0；固体培养基再添加占培养基总质量1.5%的琼脂粉；