[发明专利]一种花生体胚诱导及植株再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及花生培育方法，具体地说，是涉及一种花生体胚诱导及植株再生的方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和质量，尽管育种家们试图培育抗逆品种，但由于花生栽培种中缺乏高抗性品种资源，抗病品种的选育一直是一个难以解决的问题。目前，抗性基因的遗传转化及离体诱变育种受到国内外广泛重视。而能否将基因转化和离体诱变成功应用于花生育种，关键依赖于花生组织培养高效植株再生体系的建立。

近年来，国内外研究者开展了利用花生的不同外植体(把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体)离体培养再生植株的研究，但多数试验是通过器官发生途径再生植株，即进行初始培养的外植体经脱分化后，细胞分裂形成愈伤组织，然后细胞再度分化，进一步组织分化(即形成拟分生组织和维管组织结节)，再进行器官分化，形成不定芽，由不定芽可形成完整再生植株。通过器官发生途径再生植株，目前再生率较高的是2009年本申请人在《中国油料作物学报》上发表的论文《花生组织培养及高频率植株再生》中公开的再生率最高可达到85％左右，然而由于通过器官发生途径再生植株一般不定芽起源于多个细胞，应用于遗传转化和离体诱变时，再生植株会形成嵌合性植株。

利用花生不同外植体离体培养再生植株的研究中，有少数试验是通过体细胞胚胎发生途径再生植株的，体细胞胚胎发生是指在离体培养条件下，体细胞通过与合子胚发生相似的途径形成类似合子胚结构的过程。通过体细胞胚胎发生途径再生植株，体胚一般起源于一个胚性细胞，胚性细胞的第一次不均等分裂形成两个子细胞，处于上部的顶细胞继续发育为多细胞原胚，而处于下部的基细胞则形成胚柄类似物。这种再生方法应用于遗传转化和离体诱变时，可避免再生植株的嵌合性，但在现有利用花生体胚发生途径再生植株的研究中，一般是采用花生种子在培养基上培养5～7d后发芽形成的幼叶进行诱导培养，体胚诱导率和再生率不高。

发明内容

本发明提供一种花生体胚诱导及植株再生的方法，可以解决现有技术存在的花生体胚诱导及植株再生的方法植株再生频率低的问题。

为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种花生体胚诱导及植株再生的方法，包括如下步骤，

(1)制备体胚诱导培养基：选取MSB₅为基本培养基，在所述基本培养基中添加2，4-D制成体胚诱导培养基，2，4-D的添加量为每升所述基本培养基中添加5～10mg；

(2)选择外植体材料：将花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒，取胚小叶为外植体材料；

(3)按以下步骤进行体胚诱导及植株再生：

a将花生种子去子叶后的种胚外植体进行表面消毒，然后用无菌水漂洗后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡12～16h；

b取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离种胚的胚小叶，接种到所述诱导培养基中进行诱导培养，25～30d后形成体胚；

c将形成有体胚的外植体转移至体胚萌发培养基上进行萌发培养，每隔25～30d继代一次，继代两次后得到再生苗；所述体胚萌发培养基是由选取MSB₅为基本培养基，在所述基本培养基中添加BAP制成，BAP的添加量为每升所述基本培养基中添加4mg；

d当再生苗生长至2～3cm时，从基部切下，转移至生根培养基中诱导生根，获得完整植株；所述生根培养基是由选取1/2MSB₅为基本培养基，在所述1/2MSB₅基本培养基中添加NAA制成，NAA的添加量为每升所述基本培养基中添加0.2～0.5mg。

本发明花生体胚诱导及植株再生的方法，其中所述培养基均在培养室温度为24～26℃、光照强度为2500～3500Lx、光照时间为10～15h/d的培养条件下培养。

本发明花生体胚诱导及植株再生的方法，其中所述花生种胚的表面消毒采用75％的酒精浸泡15～25s，再用0.1％的升汞浸泡。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：