[发明专利]一种大豆遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种大豆遗传转化方法。

背景技术

大豆[Glycine max(L.)Merr.]属一年生豆科草本植物，中国是大豆的原产地，已有4700多年种植大豆的历史。大豆是重要的油料作物和粮食作物，是世界上食用油和植物蛋白的重要来源。然而，大豆再生和遗传转化的困难阻碍了大豆农艺性状的进一步提高和功能基因组研究的进展。迄今为止，从大豆表达文库中获得的超过300,000的表达序列标签(expressed sequence tages，ESTs)等待进一步的基因克隆和功能验证，这些EST序列代表着与大豆器官建成、发育状态、基因型和环境条件等的一大类基因。大豆遗传资源亟待人们去开发，并用来改良栽培大豆。

相对于玉米、水稻等作物来说，大豆的转化进展比较缓慢。Hinchee(1988)最早报道大豆转基因植株的获得，至今已经报道的大豆转化频率仍然较低。在大豆转基因中常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌介导法，其它转化方法应用的较少。McCabe等(1988)首次报道了利用微弹轰击法成功转化大豆顶芽分生组织获得转基因植株，但都为嵌合体。此后的报道采用此系统通过挑选含有被转化细胞的植株进行后期筛选，获得了非嵌合的转基因植株。由于微弹轰击法不像农杆菌法那样受靶组织的限制，其应用于其他靶细胞组织的报道也随后出现。Finer和McMullen(1991)首次报道用基因枪法转化体细胞胚性细胞团并获得了转基因植株，以后这一系统得以快速发展，成为大多数实验室采用的手段。基因枪法操作受受体材料的影响较小，且转化效率相对较高，且操作简便，可控度高。但是这种方法导入DNA分子量一般不高于10kb，且容易在植物基因组多个位点整合造成拷贝数较高，易引起基因沉默。自Hinchee等(1988)利用农杆菌转化大豆子叶节成功以来，大豆转化普遍采用的都是这种基于农杆菌介导的子叶节分生组织再生系统。由于T-DNA整合入分生组织的频率、对转化细胞的选择效率，不定芽再生频率和植株再生频率等不高，农杆菌介导的大豆子叶节转化频率一直很低。试验中人们对大豆转化过程进行了许多优化。在大豆遗传转化的过程中，尽可能选择那些致毒性强的农杆菌菌株。超声波处理(SAATsonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation)和辅助微弹轰击也可以增加浸染位点的数目，采用胚性悬浮系、未成熟子叶或子叶节等为靶组织，使农杆菌穿越表层细胞进入深层更加容易，可显著提高转化效率。虽然农杆菌介导的大豆子叶节转化频率还很低，试验操作重现性也不高，但该方法还是被大多数实验室和公司所采用用来进行转基因研究。相对于体细胞胚途径，农杆菌介导子叶节途径取材方便，培养周期短(一般8周得到再生植株)；而且所需试验条件简单，无需基因枪等设备，获得转基因植株成本相对低廉。但整个操作过程对操作人员的技术要求比较高，试验的成功往往取决于操作人员的熟练程度和经验。

近年来，Liu et al.(2004)利用农杆菌介导胚尖分生组织系统，获得了较高的转化频率。Paz et al.(2006)报道用农杆菌介导一个半种子途径，提高了子叶节途径的转化频率。但到目前为止，大豆还是公认的难转化的植物之一。这是因为大豆组织培养再生困难，可重复性差，转化频率在基因型之间差异较大，使得利用基因工程手段对大豆进行遗传改良受到了限制。因此，只有建立良好的转基因受体系统，并结合适宜的转基因方法，才有可能使转基因技术在大豆的性状改良、新品种的培育中发挥作用，并建立一条有别于常规育种技术的新途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆遗传转化方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：1)用含有外源基因的重组农杆菌溶液侵染大豆的下胚轴，得到侵染后下胚轴；

2)将步骤1)得到的侵染后下胚轴进行共培养得到共培养后下胚轴；

3)将步骤2)得到的共培养后下胚轴进行芽诱导培养得到芽诱导后的下胚轴；

4)将步骤3)得到的带芽的下胚轴进行筛选培养得到筛选后存活的下胚轴；

5)从步骤4)得到的筛选后存活的下胚轴中取下不定芽，将不定芽进行生根培养，得到转基因大豆幼苗。

所述大豆的下胚轴为具有顶端分生组织的0.5cm-1cm长的下胚轴，所述大豆的下胚轴具体为具有顶端分生组织的0.5cm、0.8cm或1cm长的下胚轴；

所述受体大豆的下胚轴按照如下方法制备：大豆种子萌发5天-6天，去除种皮、子叶、顶芽，得到具有顶端分生组织的0.5cm-1cm长的下胚轴；