[发明专利]一种甘油三酯水解酶基因有效shRNA的筛选方法

权利要求书

1.一种甘油三酯水解酶基因有效shRNA的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：A1：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；A2：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；A3：pDsRed1-C1-ATGL载体的构建；A4：shRNA有效序列的筛选。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1具体执行以下操作：根据GenBank公布的西农萨能羊ATGL序列，设计三条ATGL-siRNA及1条阴性对照序列，在siRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG的发夹环序列间隔，使单链DNA寡核苷酸内部形成发夹结构，每对单链DNA寡核苷酸两端分别带有BamH I和XhoI酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，得到shRNA的正、反义链模板。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤A2具体执行以下操作：A21：单链DNA寡核苷酸退火反应生成双链；将合成的单链DNA寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为200μM的溶液，然后进行退火反应，退火条件是：95℃×4分钟，取出置室温逐渐冷却，即获得浓度为50μM的双链寡核苷酸序列，分别标记为：ds422、ds600、ds1148；再分别取少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，A22：构建穿梭载体；用BamH I及Xho I双酶切pRNTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将所述ds422、所述ds600和所述ds1148分别与pRNTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接反应，反应条件为4℃连接过夜，得到连接产物；A23：连接产物转化；取10μL所述连接产物加入100μL感受态DH5α细菌，冰浴30分钟，42℃热激90秒，置冰浴12分钟，加入600μL LB培养液，37℃温和震荡培养45分钟，将细菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育；A24：筛选穿梭载体克隆。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述连接反应体系为如下：pENTRTM/U6，2μL；ds oligos(5nM)，1μL；5×退火缓冲液，4μL；T₄DNA连接酶，1μL；不含DNa se/Rnase的水，12μL；总体积20.0μL

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤A24具体执行以下操作：(1)穿梭载体克隆的质粒酶切鉴定：ds oligos的黏性末端与试剂盒提供的线性载体pENTRTM/U6的黏性末端互补，经连接反应后，形成环形质粒；于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种于4mL的含50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养12-16小时，取菌液2mL提取质粒，大小符合的再进行Sca I及EcoR V双酶切鉴定，产物以1.2％的琼脂糖凝胶电泳观察；(2)穿梭载体克隆的测序鉴定：取(1)中双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送测序公司以ABI377型DNA自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为测序引物U6或M13。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3具体执行以下操作：A31：构建pDsRed1-C1-ATGL克隆载体；将回收的目的基因片段与pGM-T载体连接，16℃恒温过夜，连接产物转化感受态E.coliDH5α菌株，涂布于含氨苄青霉素和X-gal/IPTG的LB培养平皿中，于37℃培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落PCR，反应结束后取10μL反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然后用Xho I和Sal I内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：10×H Buffer，2.0μL；Xho I，0.7μL；Sal I，0.7μL；pGM-T-gATGL1A1，10.0μL；ddH2O，6.6μL；总体积20.0μL；37℃水浴反应过夜，取全部反应液在1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计酶切位点的目的基因片段；A32：构建pDsRed1-C1-ATGL表达载体。