[发明专利]一种甘油三酯水解酶基因有效shRNA的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘油三酯水解酶基因有效shRNA的筛选方法。

背景技术

RNA干扰是通过双链RNA(dsRNA)介导的遗传干涉现象，它能够特异、有效地降解mRNA，从而引起基因的沉默。自2001年《Nature》杂志上首次报道在哺乳动物细胞中通过siRNA成功诱导了靶基因的特异性表达沉默后，RNA干扰技术就开始作为一项特异性基因沉默工具在哺乳动物细胞上广泛应用。2003年Rubinson等报道用病毒系统在原代培养的细胞、干细胞及转基因小鼠上都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围。目前，RNAi已发展成为调控生物基因表达的遗传学工具，广泛应用于功能依赖性遗传筛选、基因功能研究等后基因组计划研究中，并有望成为潜在的基因治疗工具。

甘油三酯(TG)是脂肪的主要存在形式，其水解过程是机体主要的能量来源。2004年，来自于三个不同的实验室的Zimmermann，Jenk ins和Villena等人，同时发现了一种性质相似的脂肪酶，分别命名为：adiposetriglyceride lipas e(ATGL)，desnutrin和phospholipase A2ξ(iPLA2ξ)，经结构和功能研究表明这三种蛋白实为一种脂肪酶，并将其统一命名为甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)。Zimmermann等对不同物种的ATGL进行研究发现，其氨基酸序列中都存在一个GXSXG(氨基乙酸-X-丝氨酸-X-氨基乙酸)模序，并且其中间的丝氨酸位点与ATGL的活性有关。此外，在ATGL的N端还发现一个α/β折叠区域(COG1752)和一个Patatin结构域(Pfam01734)，这些结构都是与脂肪酶活性密切相关的保守性区域。对ATGL缺陷型小鼠的研究发现，体内脂肪组织含量明显提高，并且在多个组织中表现出甘油三酯堆积的现象；同时，心脏由于堆积过量脂质，引起心脏功能紊乱，并最终导致死亡。

在动物细胞中应用RNA干扰技术的另一关键在于有效siRNA序列的筛选。但是截至目前，筛选有效的RNAi的序列继而构建其腺病毒载体，尚属空白。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进完善。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种甘油三酯水解酶基因有效shRNA的筛选方法。

本发明的方法包括以下步骤：A1：编码目的shRNA的单链DNA寡核苷酸片段的设计、合成；A2：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体的构建；A3：pDsRed1-C1-ATGL载体的构建；A4：shRNA有效序列的筛选。

所述的方法，其中优选的，所述步骤A1具体执行以下操作：根据本实验室克隆得到的西农萨能羊ATGL序列，设计三条ATGL-siRNA及1条阴性对照序列，在siRNA基础上，将19bp的寡核苷酸以正反向组合，中间添加GAGTACTG的发夹环序列间隔，使寡核苷酸内部形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有BamH I和Xho I酶切位点，其中正义链的3’端添加TTTTTT终止信号，得到shRNA的正、反义链模板。

所述的方法，其中优选的，所述步骤A2具体执行以下操作：A21：单链寡核苷酸退火反应生成双链；将合成的单链寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为200μM的溶液，然后进行退火反应，退火条件是：95℃×4分钟，取出置室温逐渐冷却，即获得浓度为50μM的双链寡核苷酸序列，分别标记为：ds422、ds600、ds1148；再分别取少量稀释成浓度为5nM的工作浓度，A22：连接反应-构建穿梭载体；用BamH I及Xho I双酶切pRNTR/CMV-GFP/U6载体并切胶回收，然后将所述ds422、所述ds600和所述ds 1148分别与pRNTR/CMV-GFP/U6载体酶切回收产物连接反应，反应条件为4℃连接过夜，得到连接产物；A23：连接产物转化；取10μL所述连接产物加入100μL感受态DH5α细菌，冰浴30分钟，42℃热激90秒，置冰浴12分钟，加入600μL LB培养液，37℃温和震荡培养45分钟，将细菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的琼脂平板上，置于37℃温箱孵育；A24：筛选穿梭载体克隆。

所述的方法，其中优选的，所述连接反应体系为如下：pENTRTM/U6，2μL；ds oligos(5nM)，1μL；5×退火缓冲液，4μL；T₄DNA连接酶，1μL；不含DNase/Rnase的水，12μL；总体积20.0μL。