[发明专利]一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法

权利要求书

1.一种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)分别构建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交换片段；

(2)利用所述的SpovAF-CM-Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸营养缺陷型突变菌株BS-CM；

(3)利用所述的SpovAF-Pspac-Lys转化BS-CM感受态细胞，发生一次双交换，所述的CM基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS。

2.根据权利要求1所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于所述的SpovAF-CM-Lys同源交换片段通过如下步骤得到：

(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基因和Lys基因，以pJC164.3质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的CM基因，将这三个基因分别克隆至pMD19-T载体，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-CM载体；

(2)步骤(1)所述的pMD19-T-CM经双酶切后获得CM片段，与经过相同双酶切处理的pMD 19-T-spoVAF载体连接得到pMD 19-T-spoVAF-CM载体；

(3)步骤(1)所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF-CM载体连接得到pMD19-T-S-C-L载体；

(4)以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以步骤(3)所述pMD19-T-S-C-L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-CM-LysA同源交换片段。   

3.根据权利要求1所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于所述的SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段通过如下步骤得到：

(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基因和Lys基因，以PDG-Stu质粒为模板PCR扩增得到Pspac启动子基因，将这三个基因分别克隆至pMD19-T载体，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-Pspac载体；

(2)步骤(1)所述的pMD19-T-Pspac经双酶切后获得Pspac片段，与经过相同双酶切处理的pMD 19-T-spoVAF载体连接得到pMD 19-T-spoVAF-Pspac载体；

(3)步骤(1)所述的pMD19-T-LysA经双酶切后获得LysA片段，与经过相同双酶切处理的pMD19-T-spoVAF-Pspac载体连接得到pMD19-T-S-P-L载体；

(4)以spoVAF-F(SEQ ID NO.1)为上游引物，LysA-R(SEQ ID NO.4)为下游引物，以步骤(3)所述pMD19-T-S-P-L载体为模板PCR扩增得到SpovAF-Pspac-LysA同源交换片段。

4.一种利用无抗生素抗性标记基因筛选技术筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)按照权利要求1所述方法构建无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS；

(2)构建插入失活靶基因的同源整合载体；

(3)将步骤(2)所述的同源整合载体转化步骤(1)所述的无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS，通过一次单交换和一次由于基因组结构不稳定引起的自发单交换过程，以是否能自我合成赖氨酸为筛选标记，得到两种基因型的枯草芽孢杆菌突变株，一种为枯草芽孢杆菌回复突变菌株，另一种为靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株，经PCR鉴定筛选得到靶基因失活的无抗生素抗性标记基因的枯草芽孢杆菌突变株。