[发明专利]一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)被公认为是安全菌株(GRAS)，可以使外源基因分泌表达出有活性的产物。此外，枯草芽孢杆菌遗传背景清楚、具有生长迅速、培养条件简单、良好的发酵基础和生产技术，使其在科研和工农业生产领域被广泛应用。B.subtilis作为一种重要的工业微生物，具有开发为食品级表达宿主的优势，减少用于食品行业的重组生物制品的下游分离纯化成本。

目前B.subtilis作为宿主的最大问题是其自身分泌的蛋白酶，对外源蛋白产生降解作用，严重的影响了外源目的产物的分泌表达产量。B.subtilis分泌多种蛋白酶对外源基因的降解作用早已引起许多学者的注意。国外学者通过基因敲出技术将已发现的蛋白酶基因逐个敲除，生成了DB104、DB403、WB600、WB700、WB800等蛋白酶缺陷菌株。WB800是由加拿大Sui-Lam Wong教授实验室创建的敲除了碱性蛋白酶(apr)、中性蛋白酶(npr)、金属蛋白酶(mpr)、中性蛋白酶B(nprB)、三种丝氨酸蛋白酶(epr、bpf和vpr)和胞壁蛋白酶(cwp)8种蛋白酶的菌株。该菌株已失去绝大部分的蛋白酶活力，很多基因在该宿主内实现了稳定表达。但是WB800内残留的蛋白酶仍然对某些敏感蛋白造成降解。WB800的构建也是通过传统的基因敲出过程，宿主本身携带了多种抗生素基因，不能应用于食品级工程菌，不符合食品安全标准。

传统的对枯草芽孢杆菌染色体的基因操作是通过一个正向筛选标记实现的，通常是在要失活或敲除的基因内部插入一个抗性基因，其两端即为同源交换臂，这样根据同源重组原理，修饰过的或无活性的基因将原始染色体上的活性基因置换。然而，当我们在经过一次基因修饰的菌株上再次进行基因操作，不可避免的引入第二个抗性基因；另外一种方法是通过再一次的单交换作用，将第一次引入的抗性基因切除掉。可以想见第一种方法，将会导致宿主产生多种抗生素抗性，而且多重抗生素抗性压力下有可能会改变菌株的生理特性；第二种方法的缺陷是发生一次双交换后，再发生一次单交换的频率极低，而且没有正向筛选标记，工作量相当大。

因此，建立一套枯草芽孢杆菌的无抗生素抗性标记基因的筛选技术对基础研究和应用研究具有重要推动作用。Fabret等在2002年第一次报导了枯草芽孢杆菌无标记基因组修饰的方法，原理是通过控制尿嘧啶合成的有无来起到筛选的目的。此后，先后出现了5篇这方面的报导，或是以利用抗药性筛选、利用营养缺陷型筛选和利用毒素基因/解毒素基因筛选。这些方法的共同之处是需要发生两次双交换过程达到基因修饰的目的。第一次双交换借助同源片段，第二次双交换借助所修饰的靶基因位点两侧引入的两个同向重复序列(DR)。虽然上述方法能够达到无抗生素抗性标记筛选的目的，但是构建敲除载体过程繁琐，并且重组突变效率低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。

一种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)分别构建SpovAF-CM-Lys和SpovAF-Pspac-Lys同源交换片段；

(2)SpovAF-CM-Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸营养缺陷型突变菌株BS-CM；

(3)SpovAF-Pspac-Lys转化BS-CM感受态细胞，发生一次双交换，所述的CM基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS-PS。

其中，所述的SpovAF-CM-Lys同源交换片段通过如下步骤得到：

(1)以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板分别进行PCR扩增得到spoVAF基因和Lys基因，以pJC164.3质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的CM基因，将这三个基因分别克隆至pMD19-T载体，得到pMD19-T-spoVAF、pMD19-T-LysA、pMD19-T-CM载体；

(2)步骤(1)所述的pMD19-T-CM经双酶切后获得CM片段，与经过相同双酶切处理的pMD 19-T-spoVAF载体连接得到pMD 19-T-spoVAF-CM载体；