[发明专利]抑制血管新生的融合蛋白VF及药物组合物和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白制备的生物技术，更具体地涉及用于抑制血管新生的融合蛋白及其药物组合物和应用。

背景技术

血管内皮细胞抑制因子(Vascular Endothelial Growth Inhibitor，VEGI)，特异性作用于血管内皮细胞，可以诱导处于生长期的血管内皮细胞凋亡和维持静止期的血管内皮细胞的静止状态。目前，已经报道了4种VEGI异构体，174个氨基酸的VEGI174，两个不同形式的192个氨基酸的VEGI192A和VEGI192B，后来发现的251个氨基酸的VEGI251。这些VEGI的氨基端不同，但是含有相同的151的氨基酸构成的核心序列。所有异构体都来源同一基因，通过不同的拼接而来。以人VEGI cDNA为探针，对人不同细胞与组织来源的mRNA进行了RNA杂交，结果表明，VEGI仅在脐静脉、主动脉、皮肤微血管等内皮细胞中表达。VEGI的表达与内皮细胞的生长状态密切相关，增殖状态内皮细胞的VEGI表达相对较低，而生长达到接触抑制的内皮细胞VEGI表达量显著提高，是生长状态细胞的表达几倍。目前关于VEGI的功能研究主要来自于VEGI174。

VEGI174是一个典型的II型跨膜蛋白，29-174氨基酸残基构成胞外链，表达在癌症细胞表面的全长VEGI 174对肿瘤的生长没有影响。在内皮细胞中表达时，对内皮细胞的生长也没有抑制作用。在TNF家族的其他几个成员(如：TNF和FAS配体)的研究中，科学家们曾发现，TNF和FAS配体可以从膜上切割下来，以游离的形式存在，并发挥作用。类似地，人工的重组的可容性VEGI174(S VEGI，含有VEGI174的胞外链和来自另一分泌蛋白的信号肽)，在肿瘤细胞过表达时，可抑制肿瘤的生长。这表明，全长的VEGI174对肿瘤的生长没有作用，而可溶性的VEGI对可抑制肿瘤的生长。可溶性的VEGI174也抑制牛主动脉与人静脉内皮细胞的增殖，IC50值分别为6ng/ml和60ng/ml.但100ng/ml的VEGI对人T细胞和骨髓基质细胞的增殖无影响。VEGI192A对内皮细胞的抑制能力更强，对牛主动脉内皮细胞生长抑制的IC50值只有0.272，而VEGI192B，以及VEG 251I，VEGI 251II，VEGI 251IV对牛主动脉内皮细胞的生长没有抑制作用，VEG 251III与VEGI 174相当，IC50值都是10ng/ml.VEGI251，是最丰富的VEGI异构体，含有一个推测的分泌信号肽。VEGI251的过表达导致内皮细胞的凋亡和生长的抑制。类似地，含有151氨基酸的核心序列的分泌形式的VEGI也已经证明可以启动肿瘤细胞的凋亡和生长抑制，但是能力较低。总体上，VEGI不仅是内皮细胞特异性表达的，也特异性地抑制内皮细胞的增殖，但是变体间的活性存在差异，导致这种差异的原因尚不清楚。

在体外血管生成模型中，重组人VEGI可显著抑制牛主动脉内皮细胞在胶原纤维中形成管样结构，IC50值约为30ng/ml。在体内鸡胚尿囊膜新生血管实验中，VEGI也可以剂量依赖地抑制FGF或VEGF诱导的毛细血管的生成。由此可见，不论为何种刺激血管生成的因素，VEGI均可抑制新生血管的生成。

VEGI的抗肿瘤作用也得到了实验证实。将可溶性人VEGI转染鼠源性结肠癌MC-38细胞，并将转染的肿瘤细胞皮下注射入同系的C57BL/6小鼠，结果发现注射表达可溶性VEGI MC-38细胞形成的肿瘤体积明显小于对照组，并未发现不良反应，也无体重下降。有趣的是，表达VEGI并不抑制结肠癌细胞的增殖，说明VEGI对肿瘤细胞无直接的细胞毒作用。免疫组化分析表明，肿瘤内的微血管大大减少。但未发现VEGI聚集中性粒细胞与巨噬细胞浸润肿瘤细胞。将表达可溶性VEGI的CHO细胞与人乳腺癌细胞MADAMB231混和注入裸鼠体内，发现异种移植的肿瘤生长也明显地被抑制。这些研究表明，可溶性VEGI转染人肿瘤细胞，可抑制肿瘤新生血管的生成，VEGI的抗肿瘤作用也主要来自于对新生血管生成的抑制。