[发明专利]一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术和实验方法领域，具体涉及一种荧光定量PCR反应液及荧光定量PCR方法，特别是用于长核苷酸片段的定量PCR反应液和方法。

背景技术

荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，也称为定量PCR，简称为QPCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量PCR根据化学原理的不同可分为探针法和染料法。其中Taqman荧光定量技术以Taqman荧光探针为基础。Taqman荧光探针，也称为水解探针，为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，荧光监测系统就可以接收到荧光信号。具体地，当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭；在进行延伸反应时，Taq聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生，随着扩增产物的增加，荧光增强(Heid，C.A.，J.Stevens，K.J.Livak，et al.Real time quantitative PCR[J].Genome Res，1996，6：986-994.)。

Taqman水解探针由于其特异性较高而广范地应用于荧光定量PCR实验。一般情况下，为了保证理想的扩增效率(90％～110％)，要求荧光定量PCR实验的扩增产物长度不宜超过400bp，更理想的最好能在50-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。而扩增效率低会影响实验的精确性、重复性和灵敏度。正是由于实验对扩增产物大小这种特殊的要求，导致荧光定量PCR实验用于长片段扩增产物的定量受到很大的限制。

举个例子来说，按照illumina公司solexa测序平台提供的《Preparing 2-5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing》(Part#1005363Rev.B)构建Pair End文库，在制备DNA簇(Clusters)前需要对Pair End文库进行浓度测定，然后选择合适的文库上机浓度，期望得到预期的DNA簇密度(Meyer，M.，A.W.Briggs，T.Maricic，et al.From micrograms to picograms：quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing[J].Nucleic Acids Res，2008，36：e5；Quail，MA.，I.Kozarewa，F.Smith，et al.A large genome center′s improvements to the Illumina sequencing system[J].Nat Methods，2008，5(12)：1005-1010.)。Pair End文库的片段长度为300～600bp，部分文库达800bp。有文献与参考资料报道(Smith S.，L.Vigilant，P.A.Morin.The effects of sequence length and oligonucleotide mismatches on 5′exonuclease assay efficiency[J].Nucleic Acids Res，2002，30：e111；Applied Biosystems，Primer Express Software Version3.0Getting Started Guide[EB/OL].2005)在文库定量的荧光定量PCR实验中扩增效率会随着扩增产物长度的增加而降低，为保证较好的扩增效率(90％～110％)，荧光定量PCR实验Taqman水解探针法的扩增产物大小最好保持在50bp～150bp。因此文库的片段长度是影响扩增效率的主要因素。例如，使用某Taqman PCR反应液对一定数量片段长度为300～600bp的Pair End文库进行定量，其扩增效率在85％左右。根据扩增产物遵循理论方程：Y＝X(1+E)ⁿ(其中Y＝扩增产物，X＝起始浓度，E＝扩增效率，n＝循环数)，对于同一个样品，假设扩增效率分别为85％与90％，经过20个循环后，Y₁＝X₁(1+0.85)²⁰，Y₂＝X₂(1+0.90)²⁰，由于其扩增效率的不同，结果相差1.7倍。