[发明专利]同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法

权利要求书

1.同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：

a)CyMV单克隆抗体的制备：通过同源克隆方法获得CyMV病毒外壳蛋白基因，构建原核表达载体，通过诱导表达获得CyMV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小于95%；

b)ORSV单克隆抗体的制备：通过同源克隆方法获得ORSV病毒外壳蛋白基因，构建原核表达载体，通过诱导表达获得ORSV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小于95%；

c)胶体金：将100ml 0.01%氯化金用2-3ml的1%柠檬酸三钠还原成15nm-60nm的胶体金溶液；

d)胶体金复溶液：1%牛血清白蛋白，0.5%脱脂干奶粉，0.05%叠氮化钠NaN3,1%吐温-20，0.01MpH7.0磷酸缓冲液，0.22U膜过滤，置2—8℃备用；

e)CyMV免疫胶体金溶液：用0.1mol/LK₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至7-8.5，将胶体金溶液按100ml胶体金溶液中加入0.5mg-2mg CyMV单克隆抗体，混合均匀，并加入牛血清白蛋白进行封闭，使其终浓度为0.5%-2%，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液，得到CyMV免疫胶体金溶液；

f)ORSV免疫胶体金溶液：用0.1mol/LK₂CO₃将胶体金溶液的pH值调至7-8.5，将胶体金溶液按100ml胶体金溶液中加入0.5mg-2mg ORSV单克隆抗体，混合均匀，并加入牛血清白蛋白进行封闭，使其终浓度为0.5%-2%，离心去上清液，加入十分之一体积的胶体金复溶液，得到ORSV免疫胶体金溶液；

g)将e)步骤的CyMV免疫胶体金溶液和f)步骤的ORSV免疫胶体金溶液混合并加入一定量的胶体金复溶液，直至在电子显微镜下观察到CyMV和ORSV免疫胶体金溶液均匀混合，将上述混合溶液每毫升均匀铺在22-50cm²的玻璃纤维上，干燥后形成CyMV和ORSV免疫胶体金垫；

h)将CyMV和ORSV单克隆抗体溶液分别按顺序点在硝酸纤维膜的检测线上，羊抗兔多克隆抗体点在硝酸纤维膜的质控线上；

i)分别将吸水滤纸制成的样品垫、CyMV和ORSV免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到一张带不干胶的PVC胶板上，成为试纸条；并在试纸条上粘上带有插入液体液面最高限位的指示线MAX的透明不干胶；

j)将干燥的试纸条用铝箔密封包装保存。