[发明专利]同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种免疫胶体金试纸条的制备方法，特别是一种可同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法。

背景技术

兰花由于其品种丰富、花色艳丽、花期长等特点，深受民众喜爱，成为盆花中最流行的品种，近几年来，兰花在我国的发展速度之快，远远超出了人们的预计。但是兰花及易染上病毒病，病毒在兰花植株上造成全身系统性感染，使兰株生长缓慢，叶片出现条纹、斑块、坏疽或绿色分布不均的嵌纹病征。人工栽培蝴蝶兰时所采取的任何可以造成机械性伤口的机会、栽培过病株的盆钵、甚至灌溉水均可以导致病毒的传播，加上近年来兰花产业逐渐规模化以后，为了达到快速繁殖种苗所采用的组培技术，更加速了病毒的全面蔓延。

在各种已知的兰花病害中以病毒病 (Virusdiseases) 特别容易随无性分生繁殖而散布到后代种苗。可以感染兰花之病毒种类至少有29 种。但普遍发生的只有建兰花叶病毒 (Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)、齿兰轮斑病毒 (Odontoglossumringspot virus, 简称ORSV)、和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,简称CMV)等三种。不过多项调查报告显示感染情况最普遍，对全球兰花产业影响最严重的是CyMV 及ORSV。据估计，当前我国生产者使用的蝴蝶兰种苗几乎90％以上携带这两种病毒，台湾地区生产的蝴蝶兰种苗中，这两种病毒的携带率也在70％左右。因此能有效提高兰花病毒的检测效率，不仅可以提高兰花种苗的经济效益，也可以提高国内兰花产业的竞争力。

目前对兰花病毒的检测方法主要包括指示植物法、电镜观察法、血清学方法和分子检测技术的研究，包括RT-PCR、分子探针等。

1.指示植物法：指示植物法虽然简单，但存在很多不足。在实际鉴定中多为几种病毒复合侵染，症状表现变化较大，且不同时期指示植物上的症状表现也有差异，从而增加了检测难度；检测速度慢，周期性长，需要时间3-20几天不等，且灵敏度较低；接种后的症状表现受季节的限制和外界环境的影响较大，维护指示植物园费用也高。

2.电镜观察法：这种方法简便快捷，适用于大量样品的检测，但由于电镜技术需要较高倍数的电子显微镜，而且样品的制备费用较高，提取病毒难度较大，所以电子显微镜技术受到一定的限制。

3.血清学方法：利用抗原抗体的免疫学反应来检测植物是否带病毒的方法。目前主要是采用酶联免疫吸附法(ELISA)和点免疫结合试验(DIBA)，存在以下缺点：a 只适用于大量样品的检测，不能实现单一样品的检测；b 需要专门的仪器设备和专业的技术操作人员，不利于推广；c 操作过程相对复杂，检测时间长，4-12小时不等。现也有开发了兰花病毒胶体金检测试剂纸，这是血清学方法的一种，是近年来兰花检测中较新的一种方法。由于只能进行病毒的单一检测，成本较高，没有得到推广。

4.分子检测技术：目前常用的分子生物学技术包括核酸分子杂交技术和RT-PCR方法。RT—PCR方法检测植物病毒具有灵敏、快速、特异性强等优点，其专一性和灵敏性则优于免疫学方法，且目前已开发了两种病毒的多重检测。但由于兰花病毒为RNA病毒，RNA很容易降解，提取和操作过程对于环境和技术要求较高，实验时需要昂贵的试剂和特殊的设备，只能在较好的实验室内进行，不利于普及。

5.国内2007年福建农林大学的林志铿、吴祖建等曾发明应用于兰花病毒的单种病毒检测试纸条，虽然其采用相同的原理，但是其采用的多克隆抗体，灵敏度较单克隆抗体要弱，特异性较差，同时不能同时检测两种病毒，需要分开检测，整体耗时长，并浪费耗材。

发明内容

本发明的目的是要提供一种可同时检测兰花病毒CyMV和ORSV的免疫胶体金试纸的制备方法，该试纸可以一次性快速检测CyMV和ORSV两种病毒，减少多次采样对兰花样品的污染，也可以减少不必要的耗材浪费。

本发明是这样实现的，所述同时检测兰花病毒CyMV和ORSV免疫胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：

a)    CyMV单克隆抗体的制备：通过同源克隆方法获得CyMV病毒外壳蛋白基因，构建原核表达载体，通过诱导表达获得CyMV-CP的外源融合蛋白，或者将表达纯化好的外源融合蛋白注射小鼠，制备融合细胞，并通过筛选，制备特异性高的单克隆抗体，提纯抗体，纯度不小于95%；