[发明专利]一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法

权利要求书

1.一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探针序列,在所述探针序列的5’端加上C12 分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；

步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的microRNA序列后8位反向互补序列的5’端加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物，剩余序列的5’端加上ACACTCCAGCTGGG组成正向引物；并设计通用正、反向引物，在通用反向引物5’端第1位及第5位T碱基以生物素标记，在通用正向引物的第3位和第5位碱基进行锁核酸修饰；

步骤三、在待检测的RNA中加入外源性人工合成的2种microRNA ，加入量为每50 ng待测RNA各加5 fmol；

步骤四、对待测样品RNA进行反转录反应，得到合成的cDNA；

步骤五、对所述cDNA进行预扩增反应，得到预扩增产物；

步骤六、对所述预扩增产物进行不对称PCR扩增反应，得到待测样品的PCR扩增产物；

步骤七、将所述待测样品的PCR扩增产物与特异性检测微球杂交，得到杂交反应产物；

步骤八、将所述杂交反应产物离心弃上清后，与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白反应，得到反应产物；

步骤九、用液相芯片检测仪对步骤八中的反应产物进行检测，得到检测结果。

2.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤一中偶联的体积为25 μl，每1×10⁶个荧光微球对应的特异性检测探针加入量为0.04～0.1 nmol。

3.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤二中所述通用反向引物序列为TGGTGTCGTGGAGTCG，所述通用正向引物序列为ACACTCCAGCTGGG。

4.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤三中所述外源性人工合成microRNA的序列为CAGUCAGUCAGUCAGUCAGUCAG，GACCUCCAUGUAAACGUACAA。

5.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤四中反转录反应体系为10X Reverse Transcription Buffer 2 μl, 25XdNTPs 0.8 μl, 50 U/μL 的MultiScribe^TM Reverse Transcriptase 1 μl，RNAase抑制剂1 U，所述反转录引物5 nM，RNA 50 ng，补水至20 μl，反应条件为16℃ 30 min, 60个循环的 20℃ 30 s, 42℃ 30 s， 50℃ 1 s，最后85℃，5 min灭活反转录酶，得到合成的cDNA。

6.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤五中反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μl，正向引物各50 nM，通用反向引物0.2 μM, 步骤四中合成的cDNA 2 μl，补充水至25 μl，反应条件为95℃ 15 min，18个循环的94℃ 15 s，60℃ 5 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s，最后72℃ 2 min。

7.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤六中反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μl，通用正向引物各0.1 μM，通用反向引物1 μM, 以水1：400稀释步骤五中的预扩增产物2 μl，补充水至20 μl，反应条件为95℃ 15 min，40个循环的94℃ 15 s，60℃ 1 min，最后72℃ 2 min，94℃ 3 min。

8.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤七中杂交反应体系是：33 μl的1.5×TMAC、液相芯片2.5～5 μl、待测样品的PCR扩增产物1～10 μl，空白孔以等量TE取代PCR产物，以TE补足反应体积至50 μl，52℃杂交10 min。

9.根据权利要求1所述基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，其特征是：步骤八中加入1×TMAC稀释后浓度为4 μg/ml的链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋的白反应，52℃杂交10min。