[发明专利]一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸的方法，属于生物技术领域。

背景技术

微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最早对于 microRNA 表达的研究是 1993 年由 Harvord 大学 Ambros 课题组报道的，他们在线虫（Caenorhabditis elegans ）体内发现了源于 lin-4 基因的一系列 microRNA 分子。随后，人们采用多种实验方法和生物信息学手段寻找microRNA 分子，至今已经在各种物种中已发现一万多种miRNA，人类已发现七百多种miRNA，随着研究的深入将会有新的miRNA被发现，并对其中一些分子的功能进行了深入研究。然而，这些研究依赖的一个技术关键是如何分离、检测microRNA 分子。特别是各种细胞或组织 microRNA 表达图谱还不清楚的时候，开发和改善检测 microRNA 的技术就显得尤为重要。目前常用的方法是先将 microRNA 分子扩增放大，然后再通过不同的方法来检测。因为 microRNA 的长度太短，与常用的 PCR 引物长度相当，因此用传统的扩增技术进行放大非常困难。一种比较常用的方法是先分离小片段 RNA 分子，然后在每一个分子的两端各加一个连接（核酸）分子（Adaptor） ，再根据连接分子来设计引物，最后进行 RT-PCR 扩增为下一步检测做好准备。检测 microRNA 的绝对定量或相对定量方法包括real time-PCR、Northern Blot、微阵列芯片（Microarray）、微球等不同的技术。real time-PCR是一种基于荧光染料或MGB探针检测microRNA 的方法，该方法简单快速，但均是专利技术，使用价格昂贵；Northern Blot 是一种在硝酸纤维素膜上利用同位素探针杂交检测microRNA 的方法，该方法程序复杂、耗时费力，虽然其稳定性和可靠性都比较高，但是这两种方法均不能高通量的检测多种microRNA；而 microarray 技术是利用微量点样等方法，将大量基因的寡核苷酸序列有序地固化于支持物表面，然后与待测生物样品中标记的靶分子杂交，再通过特定仪器对杂交信号的强度进行检测、分析，从而判断样品中靶分子数量的一种技术，但该技术灵敏度不如前两种方法，对样品起始量要求较大，一般需要1-10μg的RNA量，而且由于microRNA 碱基数过少，探针碱基序列的选择余地受限，不同microRNA 有不同的最适宜杂交温度，即使在相同的杂交条件下，也会引起很大程度的错配杂交，从而限制了对于相似序列 microRNA 的高效识别。另外，目前microRNA的相对定量检测时常用表达水平较高的内源性microRNA作为参考,如has-mir-16等，但研究发现这些表达水平较高的microRNA,如has-mir-16在各生物组织中及细胞中表达差异也较大，使得microRNA的相对定量检测存在一定困难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对以上现有技术存在的缺陷，提出一种新的

microarray技术，在微球上嫁接相应microRNA的核酸分子探针，利用流式细胞分离技术，可以改善传统microarray 的错配杂交问题，并可以同时检测近百种microRNA，达到高通量检测的目的。

本发明的技术原理是：利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，先在生物样品中加入定量的外源性microRNA，将microRNA进行扩增得到扩增产物，并将修饰后的含有microRNA特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测microRNA的荧光信号与外源性microRNA的荧光信号的相对水平达到相对定量检测microRNA的目的。

本发明的技术方案通过以下步骤实现：

步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探针序列,在所述探针序列的5’端加上C12 分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；