[发明专利]一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药体外诊断试剂领域，更具体地讲，涉及一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法。

背景技术                                                

长期以来结核分枝杆菌药敏试验一直是结核病细菌学诊断中十分重要的技术。但传统的结核病药敏检测方法为表型耐药检测方法，建立在结核分枝杆菌的培养基础之上，通常需要4到6周的时间，远不能满足临床治疗的需要。

随着基于PCR 技术的分子生物学诊断技术的发展及结核病耐药分子机制的逐步阐明, 依据分子生物学技术检测结核杆菌耐药基因检测方法也得到了迅速的发展。目前，特别是基于反向系列探针杂交技术的PCR-ELISA方法对临床结核杆菌进行快速药敏检测显示了极大的应用前景。与目前常规的实验室鉴定方法和其它分子鉴定方法相比，具有下列优势：首先，它可以一次实验同时对多种耐药基因的多种基因位点进行快速基因型别鉴定，具有检测信息量大的特点。其次，它可以直接对临床痰标本进行检测，因此，实验室常规的结核杆菌药敏检测时间可以从目前的4－6周缩短至6个小时，真正可能起到对指导临床医生及早准确用药的作用。此外，同DNA序列测定和最近几年发展的DNA芯片技术相比，该技术无需额外添置贵重仪器，即可以在大多数临床实验室进行推广应用。因此PCR-ELISA方法是一项非常适合在发展中国家临床实验室开展使用的新型耐药基因快速检测技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种特异性好、准确度高且适用于大规模检测的基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法。

为了解决上述问题，本发明提供一种基于PCR-ELISA的结核分枝杆菌耐药基因检测方法，包括以下步骤：（1）针对rpoB基因突变位点（依据Genbank中结核分枝杆菌标准株H37Rv的全基因序列和rpoB基因序列，GenBank登录号：L27989）设计11个探针，且将所述探针点样于96微孔板；（2）每一个检测样本的DNA分3个反应管，每管中都加入rpoB-F和rpoB-R两种引物，每对引物中的下游5’端均带有地高辛标记，经PCR扩增出大量含有所述地高辛标记的结核分枝杆菌相应的基因片段产物；（3）将所述扩增产物与所述探针进行特异性杂交，杂交后带有所述地高辛标记的目标基因与所述探针结合在一起，洗去未结合的片段，通过ELISA反应，测量OD值得出结果。

步骤（1）中11个探针分别为：

MTC ：5’-CGCTGTCGGGGTTGACCCA- 3’，序列如SEQ ID NO:1所示；

RW1 ：5’-CAGCCAGCTGAGCCAATTCA-3’，序列如SEQ ID NO:2所示；

RW2 ：5’-AATTCATGGACCAGAACAACCC-3’ ，序列如SEQ ID NO:3所示；

RW3 ：5’-CCGCTGTCGGGGTTGACC-3’ ，序列如SEQ ID NO:4所示；

RW4 ：5’-GTTGACCCACAAGCGCCGA-3’ ，序列如SEQ ID NO:5所示；

RW5 ：5’-GACTGTCGGCGCTGGGGC- 3’ ，序列如SEQ ID NO:6所示；

RM2： 5’-AATTCATGGTCCAGAACAACCC -3’ ，序列如SEQ ID NO:7所示；

RM4a：5’-GGTTGACCTACAAGCGCCGA- 3’ ，序列如SEQ ID NO:8所示；

RM4b：5’-GTTGACCGACAAGCGCCGA- 3’ ，序列如SEQ ID NO:9所示；

RM5a：5’-GACTGTTGGCGCTGGGGCC- 3’ ，序列如SEQ ID NO:10所示；

RM5b：5’-GACTGTGGGCGCTGGGGCC-3’，序列如SEQ ID NO:11所示。

步骤（2）中两种引物分别为：

rpoB-F：5’-GTGGTCGCCGCGATCAAG-3’ ，序列如SEQ ID NO:12所示；

rpoB-R：5’-CACGTCGCGGACCTCCAG-3’ ，序列如SEQ ID NO:13所示。