[发明专利]一种cot-1DNA、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种c_ot-1DNA、其制备方法及用途。本发明还涉及一种核酸杂交的方法、含有本发明的c_ot-1DNA的组合物、一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒、以及本发明的c_ot-1DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。

背景技术

在分子生物学中，将C_ot＝1的一类DNA定义为C_ot-1DNA。其中，C_ot是DNA复性动力学中的一个单位，表示的是单位浓度(C_o，mol/L)下DNA单链的复性时间(t，sec)，Cot值实际上是杂交液中单链起始浓度(C_o)和反应时间(t)的乘积。在相同的条件下，DNA重复序列的C_ot值小，而非重复序列具有较大的C_ot值。

C_ot-1DNA通常作为DNA竞争性阻断剂，在基因组杂交中阻断可能引起非特异性杂交的重复序列。例如，当用含有重复序列的探针来进行Northern杂交、Southern杂交、FISH定位和体细胞原位杂交等实验时，存在于探针中的重复序列将会产生广泛的非特异性强杂交背景信号，从而将那些要检测的低拷贝或单拷贝序列的杂交信号掩盖掉。所以，在进行以上实验操作时，应首先考虑去掉探针中的这些重复序列避免非特异性杂交信号。从而达到捕获单拷贝或低拷贝序列外显子，增强外显子的检测信号的目的。最理想的方法是采用过量的基因组重复序列DNA，如c_ot-1DNA来预先对这类探针进行封闭杂交，去掉存在于探针中的那些重复序列DNA(革文新等，人c_ot-1DNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期，(127))。

序列捕获(exon capture)将全基因组中感兴趣的目标序列和区域分离出来进行后续研究的技术。序列捕获技术的兴起能更好的将测序这种方法应用到分析、疾病诊断以及个性化(个体化)医疗等新领域。但是，如果要快速、大规模地实施序列捕获技术，获取大量的基因组重复序列就显得十分必要了。

目前查到的c_ot-1DNA的制备方法主要是采用羟基磷石灰柱层析法(HAP柱分离法)分离制备c_ot-1DNA。该方法是将获得的基因组DNA用超声波打断到需要大小，根据HAP的吸附能力和分离柱所装的HAP的量计算出所需要用的打断的DNA的量，100℃变性10min，冰浴骤冷，按照公式c_ot＝1＝mol/L×Ts计算DNA复性时间t，于60℃ c_ot-1DNA复性t秒，复性结束后，立即置于冰浴中10min，加入等体积的水溶液，将样品加入到HAP分离柱上，经过调整磷酸盐的浓度，依次洗脱游离核苷酸等杂质，单链核苷酸，最终洗脱c_ot-1DNA洗脱峰，并收集，用两倍体积的乙醇室温沉淀收集的c_ot-1DNA，8000r/min室温离心20min，用适当的水溶解所得到的盐和c_ot-1DNA所得到的共沉淀混合物，然后用Sephadex G-50脱盐，收集DNA峰，加入1/10体积3M的醋酸钠，和两倍体积的酒精8000r/min4℃离心20min，收集沉淀得到c_ot-1DNA(革文新等，人c_ot-1DNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期(127))。

但是，上述的c_ot-1DNA的制备方法——HAP柱分离法，虽然制的产品效果可以满足杂交的需要，但是制作方法繁琐，且耗时耗力。

目前，Invitrogen公司的商品c_ot-1DNA是常见的商品化的c_ot-1DNA，但是价格较为昂贵。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种制备c_ot-1DNA的方法，包括下述步骤：

1)将基因组DNA打断成100bp-1000bp的DNA片段；

2)将打断的DNA片段进行纯化；

3)将纯化后的DNA片段进行变性、复性；

4)去除经过步骤3)所得DNA产物中的单链DNA；

5)将步骤4)中得到的DNA片段产物进行纯化，得到c_ot-1DNA。