[发明专利]奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法，其特征是：

(1)通过对奶牛乳腺炎奶样金葡菌、链球菌、大肠杆菌分离、鉴定，筛选并确定金葡菌流行优势株是5、8和336血清型、链球菌流行优势株是无乳、停乳和乳房血清型、大肠杆菌O008、O1216、O2138、O2555等为我国奶牛乳腺炎感染流行优势菌株，三种细菌占感染菌的92％以上；

在本方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、O008、O1216、O2138和O2555型大肠杆菌作为奶牛乳腺炎优势流行菌株；包括任何适宜于当前和今后广泛流行金葡菌、链球菌、大肠杆菌野生株、突变株；

(2)通过构建自杀性致死质粒pCVD442-galE系统，运用同源重组常规方法敲除O008、O1216、O2138和O2555大肠杆菌候选优势菌株的LPS编码基因galE以暴露其核心抗原，而不影响除O抗原之外的其它抗原的免疫原性，筛选并命名为X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌重组工程菌(简称X-大肠杆菌)株，在体外普通培养基中生长良好，传代稳定、免疫原性良好的奶牛大肠杆菌乳房炎疫苗优势候选菌株；

在本方法中，包括但不局限X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌重组工程菌株作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株；包括通过该方法制备的奶牛大肠杆菌基因工程菌(称奶牛大肠杆菌，又称X-大肠杆菌)株均可用作为候选疫苗株；

(3)制备了奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌优势流行菌株兔抗血清，分别与已有国内外临床分离奶牛乳房炎金葡菌、链球菌和大肠杆菌菌代表株进行中和试验，其免疫交叉保护达96％以上，由此选用的5、8、336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大肠杆菌感染奶牛乳房炎优势疫苗菌株具有代表国内外流行株；

(4)选用5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌感染奶牛乳房炎优势疫苗株，通过培养传代、建立了5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555等大肠杆菌奶牛乳房炎灭活疫苗原始种子批、主种子批和工作种子批库，进一步通过理化性质、基因特征、毒理和免疫原性等全面分析。表明建立的奶牛乳房炎三联灭活疫苗菌株三级种子批库符合疫苗生产用要求；

在本方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌重组工程菌株作为奶牛乳腺炎疫苗候选优势菌株建立种子批库；包括适用于当前和今后广泛流行的金葡菌、链球菌、大肠杆菌野生株、突变株建立疫苗株种子批库；

(5)通过奶牛乳房炎5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌三联灭活菌苗工作种子批株，从10L到1000L发酵放大培养，制备了奶牛乳房炎三联灭活菌苗原液，经甲醛灭活、离心分离、生化提取制备纯化5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌血清型灭活全菌、荚膜多糖抗原，抗原纯度达95％；通过对温度、时间、接种量等培养条件的优化，获得了规模化生产灭活全菌、荚膜多糖疫苗抗原原液；进一步进行血清型别、理化性质、基因特征、外源因子、免疫原性等全面鉴定；

在本方法中，包括不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌、X-10、X-89、X-326、X-2138和X-2555大肠杆菌菌苗工作种子批株、BHI、TSB培养基用于疫苗原液规模化生产；包括适用于当前和今后广泛流行的候选金葡菌新优势疫苗菌株及LB等培养基介质；

(6)纯化的奶牛5、8和336血清型金黄色葡萄球菌、无乳、停乳和乳房链球菌乳房炎灭活荚膜多糖疫苗原液，用偶联剂与破伤风毒素蛋白(TT)、白喉毒素蛋白(DT)、无毒力白喉毒素蛋白(CRM197)或其他合适的载体蛋白分子；依Pr-L-Ps结构式偶联，其中，Pr是载体蛋白，Ps是奶牛金葡菌荚膜多糖，L是共价键、或连接基团，且Ps∶Pr的质量比为0.5-3.5∶1；先采用溴化氢活化多糖，然后再采用碳二亚胺将活化的多糖与蛋白共价偶联；制备出奶牛金葡菌、链球菌乳房炎荚膜多糖结合蛋白抗原原液，TT或DT或CRM197载体蛋白与各血清型荚膜多糖结合蛋白都有好的交联效果，交联率达85％以上，由此TT或DT或CRM197均可作为该疫苗载体结合蛋白；

在本方法中，包括但不限于5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌灭活荚膜多糖和TT、DT、CRM197交联载体蛋白；包括适用于当前和今后广泛流行金葡菌、链球菌株荚膜多糖及其他载体蛋白；

(7)制备的有效剂量纯化奶牛5、8和336型金葡菌、无乳、停乳和乳房型链球菌乳房炎灭活全菌(比如1～10×10¹⁰CFU)、全菌(比如1～10×10¹⁰CFU)+荚膜多糖(比如10～60Ug)抗原、荚膜多糖结合蛋白抗原(比如40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197)、X-10大肠杆菌乳房炎灭活全菌(比如1～10×10¹⁰CFU)，与常规用量的白花油、FIA、铝盐、MF59、SP01和SP02等疫苗佐剂均匀，制备奶牛乳房炎三联(金葡菌、链球菌、大肠杆菌)灭活全菌、全菌+荚膜多糖、荚膜多糖结合蛋白疫苗，分别免疫BALB/c鼠、家兔和奶牛动物，间隔28天，皮下或肌肉或乳头管或微针透皮免疫2次，间断采集奶汁、血清、血细胞及脾细胞，观察奶牛产奶量与质量、体温、体重、体细胞计数、细菌计数及ELISA、ELISPOT测定抗体效价、细胞免疫水平及死亡情况；试验结果可见，这几种佐剂均能提高奶牛乳房炎灭活疫苗抗体滴度、依次是FIA、白花油、SP01、MF59和铝盐佐剂，且在不同动物呈现一致性趋势；由此SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐均可有效的作为奶牛乳房炎三联灭活疫苗的佐剂；

在本方法中，包括但不限于SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种用于奶牛乳房炎三联灭活疫苗的制备；包括免疫刺激复合物、细胞因子、脂质体等佐剂；

(8)、本发明的奶牛乳房炎三联灭活疫苗可不含有佐剂，也可以含有SP01、SP02、MF59、白花油、FIA和铝盐佐剂中的一种或几种，①制备有效剂量的有或无佐剂的奶牛乳房炎单联灭活(比如1～10×10¹⁰CFU金葡菌或1～10×10¹⁰CFU链球菌或1～10×10¹⁰CFU X-大肠杆菌)全菌疫苗注射剂型、三联灭活(比如1～10×10¹⁰CFU金葡菌+1～10×10¹⁰CFU链球菌+1～10×10¹⁰CFU X-大肠杆菌)全菌疫苗注射剂型；②制备有或无佐剂的奶牛乳房炎单联灭活(比如1～10×10¹⁰CFU全菌+荚膜多糖10～60Ug金葡菌、1～10×10¹⁰CFU全菌+荚膜多糖10～60Ug链球菌)疫苗注射剂型、三联灭活(比如1～10×10¹⁰CFU全菌+荚膜多糖10～60Ug金葡菌+1～10×10¹⁰CFU全菌+荚膜多糖10～60Ug链球菌+1～10×10¹⁰CFU X-大肠杆菌)全菌+荚膜多糖疫苗注射剂型；③制备有或无佐剂的奶牛单联灭活(比如40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197金葡菌或链球菌)荚膜多糖结合蛋白疫苗注射剂型、三联灭活(比如40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197金葡菌+40～60Ug/CPs-10～20Ug/TT或DT或CRM197链球菌+1～10×10¹⁰CFU X-大肠杆菌)荚膜多糖结合蛋白疫苗注射剂型、微针透皮剂型。