[发明专利]奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种奶牛乳房炎三联灭活疫苗及其制备方法，特别是含奶牛乳房炎5、8、336型金黄色葡萄球菌、无乳、停乳、乳房型链球菌和大肠杆菌三联灭活疫苗及其制备方法，其疫苗类型包括灭活全菌疫苗、灭活全菌+荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合蛋白疫苗注射剂型、微针透皮剂型，可安全、稳定、全面有效预防金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌感染性奶牛乳房炎的发生。属于生物制药领域。

背景技术

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是危害畜牧业发展、食品安全、人类健康的重大传染病，特别是近年气候环境改变、抗生素滥用耐药，超级细菌出现，细菌感染奶牛乳房炎发病率和死亡率逐年攀升，严重危害畜牧业发展、食品安全和人类健康，由此再次给人们敲响警钟，奶牛乳房炎已成为国计民生的头等大事，采用免疫疫苗防控势在必行。

据国际奶牛联合会报告，全球有2.2亿头奶牛，因理化所致奶牛乳房炎发病率明显下降，而微生物感染奶牛乳房炎呈显著上升，其发病率高达60％以上。引发奶牛乳房炎的病原达140余种，主要是细菌类占主流，其中金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)、链球菌和大肠杆菌感染占90％以上，且可多种病原菌共同或单独感染引起。据临床流行病学资料显示，我国奶牛乳房炎以金葡菌、链球菌和大肠杆菌病原菌为主，占91.4％，其中金葡菌以5、8和336型、链球菌以无乳、停乳和乳房型、大肠杆菌O型为主，与当前国际报道感染菌种、血清型及流行趋势相一致。奶牛乳房炎不但影响奶牛生活质量和产量，而且经济损失也明显突出，如发达美国每年达30亿美元、英国4亿美元，我国35亿元以上，特别是我国奶制品及肉食品抗菌素及细菌产物严重超标，已成为国计民生的社会重大问题。

目前奶牛乳房炎治疗是以抗生素为首选，但大量抗生素使用造成耐药，而得不到有效控制，已严重影响畜牧业健康发展。人们最大愿望就是通过接种疫苗有效控制奶牛乳房炎，其目的就是增强机体免疫应答反应，特别是乳腺组织的免疫应答反应来阻止、中和、杀灭外界进入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特点给有效免疫力的产生带来了了一系列特殊的挑战。第一，乳房炎是乳腺组织的炎症，然而免疫应答增强在奶牛患乳房炎的情况下并不总是有益的。免疫反应的一个重要组成部分是大量的嗜中性粒白细胞从血液迁移到感染的乳腺来发挥作用。在实际生产中，牛奶中出现大量体细胞并不认为是好事，因为体细胞数量增加说明奶牛已患乳房炎，并且此时牛奶品质、产量会明显下降。第二，乳腺中的牛奶会稀释抗感染的嗜中性粒细胞的浓度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中性粒细胞的杀菌能力。第三，奶牛饲养有大量可引起乳房炎的微生物的环境中，而且奶汁本身给病原菌生长提供了温床。因此，使奶牛乳腺产生有效的免疫力，降低乳房炎的发生率，需要攻克的难题较多，给奶牛乳房炎疫苗研发提出比其它传染病疫苗更高的要求。

细菌感染奶牛乳房炎菌多而复杂，主要是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌(Streptococcus)和大肠杆菌(Escherichia coli)，与宿主交互作用免疫应答及免疫保护复杂性，疫苗佐剂在疫苗中发挥的重要作用更佳凸现，它决定免疫抗原走向及免疫应答特征，已成为奶牛乳房炎疫苗研发的重要内容。目前动物疫苗使用的多为白花油佐剂，能产生高滴度血清抗体，但没有黏膜和细胞免疫应答，尤其是副作用大，而影响奶牛质量和奶产量及生活质量。近些年，以色列Gabriel Leitner等研制的奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌苗“MASTIVACS I”，曾与FIA(freund’s incomplete adjuvant)和ISA206(vaccine adjuvantfor w/o/w emusion based onmineral oil)佐剂效果比较，发现FIA对小鼠的刺激性较大，认为ISA206佐剂比较适合。我国罗金印等曾研制的氢氧化铝佐剂灭活苗、靳亚平等研制的葡聚糖、油佐剂和弗氏不完全佐剂奶牛乳房炎疫苗结果表明，3种以FIA佐剂效果最好，但存在副作用大。本发明者采用SP01佐剂(角鲨烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油佐剂)、SP02佐剂(角鲨烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚水包油佐剂并加入重组细菌鞭毛)作为奶牛乳房炎灭活疫苗佐剂。结果显示SP01、SP02佐剂具有全面免疫应答效果，且副作用显著低于白花油和FIA佐剂，成为新一代有发展前途的疫苗新佐剂。