[发明专利]一种溶菌酶及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子微生物学领域，具体的说是一种溶菌酶(lysozyme)及其制备和应用。

背景技术

溶菌酶(EC 3.2.1.17)，又名胞壁质酶(muramidase)，是一种糖苷水解酶，能降解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，从而破坏细胞壁，使得细菌由于渗透溶解而死亡。溶菌酶广泛存在于各种生物中，包括人类、动物、植物、鸟类等。基于其抑菌效应，溶菌酶在多种生物中皆是重要的天然免疫因子，在抵抗细菌入侵过程中发挥作用。与其它抗菌因子相比，溶菌酶具有活性稳定、可以冷冻或干燥处理、抗菌谱广等优点，因此，溶菌酶在医学和食品工业中被用作抗感染物质和防腐剂。

发明内容

本发明目的在于提供一种溶菌酶及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种溶菌酶：溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。

溶菌酶的制备：

1)质粒pLysG的构建：

以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBLysG

将上述质粒pBLysG和质粒pPIC9H分别用限制性内切酶EcoRV和SnaBI酶切，回收0.58kb和9.2kb片段，将这二片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为质粒pLysG；

2)溶菌酶的表达和制备

将上述步骤1)的质粒pLysG转化入酵母GS115内，在含有安卡青霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为GS115/pLysG；

将转化子GS115/pLysG进行诱导表达后，收集上清，将上清用UltraCentrifugal Filter Devices浓缩20-25倍后，浓缩后的上清即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的溶菌酶。

所述步骤1)中F1为5’-GATATCATGGGTTATGCAAATATCAAGG-3’；R 1为5’-GATATCAAACCCATTCCTTTTGTACCA-3’。

溶菌酶的应用：所述序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列的溶菌酶可作为抑菌剂。

所述溶菌酶可作为革兰氏阳性或革兰氏阴性菌的抑菌剂。所述溶菌酶可作为哈氏弧菌、海豚链球菌、创伤弧菌或副溶血弧菌的抑菌剂。

本发明具有如下优点：

1.稳定表达。本发明的酵母表达系统可以稳定高效地表达溶菌酶。

2.广谱、高效抑菌作用。本发明的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，因而可以用于防控细菌性疾病。

附图说明

图1为本发明实施例纯化得到的溶菌酶田永图谱(其中，纯化得到的溶菌酶为泳道2；泳道1：分子量marker。)。

图2为本发明实施例溶菌酶的杀菌效应图。(其中，图A为本发明实施例溶菌酶产生的抑菌圈；图B为PBS阴性对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法(Sambrook and Russell：MolecularCloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；酵母转化按Invitrogen公司的方法(Catalog no.V175-20)；聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照Sambrook and Russell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

本发明的溶菌酶为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。

序列表SEQ ID No.1为：