[发明专利]一种芽孢杆菌及其酯酶的提取方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌及其酯酶的提取方法和应用。

背景技术

有机磷农药在保护农作物免受病、虫害，提高粮食产量方面具有巨大作用，但其过度使用经常导致蔬菜和水果等农产品农药残留超标，直接危害人们的身体健康，因此有效控制农产品的农药残留是我国当前解决食品安全问题的主要任务之一。减少农产品农药残留危害的最有效的途径之一是建立快速有效的农药残留检测方法。目前国内大部分的农贸市场都在使用酶抑制法来检测果蔬的有机磷农药残留，该法涉及了酶试剂、底物和显色剂，其中的关键技术是对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的酯酶的提取和获得。目前国内现有的用于规模生产的酯酶都是从动物中提取的，主要还存在以下缺点和问题：(1)筛选酶源工作量很大、成本较高；(2)酶来源不稳定，不同批次不同个体来源的酶的差异较大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种成本低、灵敏度高以及酶来源稳定的芽孢杆菌酯酶的提取方法。

该菌命名为芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8，编号为。

本发明芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8的分子分类地位的确定。

该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

该菌株在平板上的菌落呈圆形、浅黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐。 细胞呈杆状，直径0.8μm左右，长度约2-3μm，革兰氏染色为阳性，芽孢呈椭圆形，近端生。

对该菌株进行的抗生素抗性、接触酶实验结果表明，菌株对萘啶酮酸和大观霉素有抗性，接触酶实验结果为阳性。

本发明还提供了芽孢杆菌酯酶的提取方法，包括以下步骤：

(1)斜面菌种：将芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8接种到营养琼脂斜面上培养；

(2)扩大种子液培养：将斜面菌种接种到装有种子培养基的三角瓶中，37±3℃，100-300rpm，摇床培养12-14小时；

所述种子培养基为蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.5％，pH7.0；

(3)发酵培养：将扩大培养种子液接种到发酵培养基中，于37±3℃培养24-26小时；

所述发酵培养基为：葡萄糖1％，蛋白胨2％，K₂HPO₄0.1％，NaH₂PO₄ 0.1％，pH7.0；

(4)芽孢杆菌酯酶的提取：将发酵菌液3000-5000rpm离心10-20min，收集菌体，用0.01-003mol/L pH7.0磷酸缓冲液洗涤后再次用磷酸缓冲液悬浮，用超声波破壁法提酶，3000-5000rpm离心10-20min，所得上清即为芽孢杆菌酯酶。

本发明还提供了该芽孢杆菌酯酶在农药残留检测方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明以一株芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8为出发菌株进行发酵后提取酶液，该酶在菌种不发生变异的情况下其性质完全相同，重复性好，克服了不同动植物个体来源的酯酶存在差异的问题。

2.本发明以芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8进行发酵提取酶液，不 需要筛选酶源，也不需要纯化，降低了酶提取的工作量和成本。

3.本发明提供的芽孢杆菌酯酶在甲胺磷、敌敌畏浓度分别为0.3ppm、0.005ppm时抑制率都高于50％，使检测限度远低于相关的国家标准，克服了目前产品对有机磷农药的敏感度不高，特别是对甲胺磷等的敏感度低的缺点。

本发明芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8已于2010年11月9日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为No.CCTCC M 2010295。

具体实施方式

实施例1

本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus brevis)GDXEase8具有下述性质：

1.形态特征

菌株在平板上的菌落呈圆形、浅黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐。细胞呈杆状，直径0.8μm左右，长度约2-3μm，革兰氏染色为阳性，芽孢呈椭圆形，近端生。

2.生理生化鉴定

对菌株进行的抗生素抗性、接触酶实验结果表明，菌株对萘啶酮酸和大观霉素有抗性，接触酶实验结果为阳性。

3.16SrDNA序列