[发明专利]一种用于猪、人和蚊子中乙型脑炎病毒抗原检测的ELISA试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学与免疫学技术领域。具体涉及一种利用乙型脑炎病毒鼠源单克隆抗体和兔源多克隆抗体建立的检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒及应用，该试剂盒可用于快速检测猪、人、蚊子等多种临床样品中乙型脑炎病毒抗原。本发明提供了乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体和兔源多克隆抗体的制备及纯化，以及用该单克隆抗体和多克隆抗体建立的可以检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA检测方法。 

背景技术

乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE，下文称之为JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV，下文称之为JEV)引起的一种严重的人畜共患的虫媒病毒性疾病，近年来其在东南亚的流行分布范围正在不断扩大。该病毒主要经过蚊子进行传播，猪是该病毒的主要自然宿主和传染源，感染后可引起母猪流产、死胎、木乃伊胎及公猪发生睾丸炎，对公众健康及畜牧业的发展都造成了严重的影响。 

JEV属于黄病毒科(Flaviridae)，黄病毒属，病毒基因组为单股正链RNA，长约11kb，病毒RNA只含有一个长的开放阅读框架，该框架可分为二个区段：近5’末端1/4区段编码病毒的三个结构蛋白基因，主要包括C，M(PrM)以及E蛋白基因；近3’末端3/4区段编码7个非结构蛋白基因，主要包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。其中，E蛋白是乙型脑炎病毒的主要结构蛋白，是病毒表面最重要的成分，它与病毒粒子的吸附、穿入、致病和诱导宿主的免疫应答等密切相关，同时E蛋白是体外中和作用的主要靶位点和特异性抗体的作用位点，可激发中和抗体和保护性免疫，针对E蛋白的特异性单克隆抗体具有很高的中和活性，对乙型脑炎的感染有很强的保护作用。 

我国是乙型脑炎病的高发国家，历来重视对乙型脑炎的检测及防治。迄今，国内用于乙型脑炎检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测两大类。对抗原的检测主要包括病毒的分离鉴定、分子生物学方法如RT-PCR等，该类方法检测周期长、操作繁琐、对实验条件要求严格，不适用于临床大规模检测。针对抗体的诊断方法主要指血清学检测方法，如空斑减数中和试验(Plaque reduction neutralization test)、补体结合试验(Complement Fixation Test，CFT)、血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test，HIT)等，但这些传统的抗体检测方法也仅能用于疫苗免疫效果的评价，不能用于对病毒感染情况的监测。因而建立一种快速、简便、特异、灵敏的病原检测方法，并能够同时应用于临床患者及感染动物的诊断，就成为了乙型脑炎防治技术研究中的一项重要课题。 

目前，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙型脑炎抗体的方法已有不少报道。例如有的是采用抗体捕捉ELISA检测血清中的IgM用于乙型脑炎的早期诊断(张明杰等，快速IgM抗体捕捉ELISA的建立及其在乙型脑炎早期诊断中的初步应用.病毒学杂志.1989，3：251-154；)；有的是应用间接ELISA测定乙型脑炎病人血清中的特异性IgG(顾方舟等，酶联免疫吸附法ELISA测定乙型脑炎病人血清中特异性IgG.北京医学.1981，1-4)；也有应用乙型脑炎病毒的囊膜E蛋白或非结构蛋白建立的检测抗体的间接ELISA方法(张宁等，猪乙型脑炎病毒囊膜E蛋白间接ELISA诊断方法的建立与初步应用.中国畜牧兽医，2010，37(7)：170-175；吴鹏等，乙型脑炎病毒非结构蛋白NS1的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的初步建立.畜牧与兽医.2010，42(3)：5-8)。但针对乙型脑炎抗原的检测方法则少有报道，而同时能用于猪、人和蚊子样品中乙型脑炎病毒检测的ELISA方法则未见报道。 

虽然针对乙型脑炎抗原及抗体的ELISA检测方法国内已开展了以上一些相关研究，但无论是在人医还是兽医领域，至今仍没有一项完善的既能用于人的乙型脑炎抗原检测，又可以用于猪、蚊子等多种动物样品中乙型脑炎抗原检测的成熟方法。因此，建立一套快速、灵敏并面向基层的乙型脑炎抗原检测方法也就成为了防控乙型脑炎课题中的重要内容。 

已证实，利用乙型脑炎病毒囊膜E蛋白制备的单克隆抗体具有很高的中和活性，它可以与乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位发生特异性的结合。而利用病毒多个抗原表位制备的多克隆抗体则具有结合力更强、反应效果更好的特性，所以利用这两种抗体构建的检测乙型脑炎抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，并可用于多种临床样品的检测，这将为乙型脑炎的诊断和防治提供有效的工具。 

发明内容