[发明专利]一种T载体介导的测定3′端侧翼未知序列的方法

权利要求书

1.一种pUCm-T载体介导的PCR扩增已知DNA序列3′端侧翼未知序列的方法，其特征在于：对基因组DNA用限制性内切酶进行双酶切；纯化的酶切产物采用Taq酶或Ex Taq酶补齐和3′端加A，与pUCm-T载体连接；利用引物设计软件选定T载体T/A克隆位点下游的一段序列的互补序列作为3′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA上的两段序列作为5′端引物；以pUCm-T载体连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增；

(1)PCR引物的设计：根据已知DNA序列设计两条5′端特异性引物，命名为Primer-F1和Primer-F2(18-22bp)；Primer-F2的3′端距待测序列要保留30bp以上长度，它比Primer-F1接近待测的未知序列；针对本发明引入的pUCm-T载体，在其T/A克隆位点的下游选定一条3′端特异性引物，命名为T-PrimerR(20bp，Tm值58℃)；

(2)限制性内切酶的选择：根据对已知DNA序列上限制性内切酶位点的分析，选用从Primer-F1到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种内切酶；本发明可供选择的常用的产生5′粘性末端的限制性内切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等，产生平齐末端的有EcoRⅤ、SnaBⅠ和ScaⅠ等，产生3′粘性末端的有BmtⅠ、PstⅠ、SacⅠ和KpnⅠ等；

(3)PCR模板的构建：运用步骤(2)选择的两种内切酶对基因组DNA进行酶切，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3′端加A反应，与pUCm-T载体连接，即可作为PCR模板；此步骤若选用的两种内切酶都是5′粘性或平齐末端，只需选用普通Taq酶，否则需要选用带有3′→5′外切酶活性的Ex Taq酶；

(4)巢式PCR扩增：以步骤(3)的pUCm-T连接物为模板，采用Primer-F1和T-PrimerR为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，采用Primer-F2和T-PrimerR为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。

2.根据权利要求1所述的方法，操作过程中所使用的反应体系和条件如下：

(1)按如下的体系和条件双酶切宇佐美曲霉E001基因组DNA(以SalⅠ和BamHⅠ为代表)：10×T Buffer 3μl，SalⅠ 1μl，BamHⅠ 1μl，基因组DNA 10μl，无菌水5μl；将该体系在37℃水浴中反应4h；纯化回收双酶切产物并溶于20μl无菌水中；

(2)按如下的体系和条件对酶切产物进行补齐和3′端加A(以宇佐美曲霉E001的cel12A基因为代表)：酶切产物20μl，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，Taq酶0.25μl，无菌水1.75μl；72℃反应10min；目的产物命名为cel12A3UT；

(3)按如下的体系和条件连接cel12A3UT与pUCm-T：50％ PEG40001μl，10×T4DNALigase Buffer 1μl，pUCm-T 1μl，T4 DNA Ligase 1μl，cel12A3UT 6μl；16℃连接过夜；目的产物命名为pUCm-T-cel12A3UT；

(4)按如下的PCR体系和条件进行第一轮的PCR扩增：10×PCR Buffer 5μl，dNTP 3μl，pUCm-T-cel12A3UT 5μl，Cel12A-F1 1μl，T-PrimerR 1μl，水34.5μl，Taq酶0.5μl；94℃ 4min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min；首轮PCR产物命名为Cel12A3UT-Out；按如下的体系和条件进行第二轮的PCR扩增：10×PCR Buffer 5μl，dNTP 3μl，cel12A3UT-Out1μl，Cel12A-F2 1μl，T-PrimerR 1μl，水38.5μl，Taq酶0.5μl；94℃ 4min，30个循环(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)，72℃ 10min；第二轮PCR产物命名为cel12A3UT-In。