[发明专利]一种T载体介导的测定3′端侧翼未知序列的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，是一种利用限制性内切酶(Restriction Endonuclease)酶切、pUCm-T载体连接和巢式PCR(Nest Polymerase Chain Reaction)扩增等技术，基于部分已知DNA(Deoxyribonucleic Acid)序列确定其3′端侧翼未知DNA序列的方法。

背景技术

随着生物工程技术的发展，越来越多的功能性蛋白质逐步地被报道出来。为了使功能性蛋白质实现高水平表达以便于后期的分离纯化和工业化生产，人们开始研究它们的基因序列和异源表达，从而推动基因组学的发展。但现在报道的许多新基因仅获取了部分DNA序列，而不了解某个基因完整的DNA序列时，就无法深入研究其结构和功能，因此需要从它的部分已知DNA序列获得完整序列。随机测序法是通过大量的随机测定DNA序列，借助计算机进行排序的方法来获取所需要的DNA序列，而该方法存在很大的偶然性，通常会耗费很大的人力和物力。3′-和5′-RACE(3′and 5′Rapid Amplification of cDNA Ends)法是在已知部分mRNA序列的情况下，获取目的基因完整的mRNA序列，但不能确定基因的上下游调控元件序列。另外，RACE法较繁琐，mRNA又极其不稳定，反转录还特别容易受到丰度低和高级结构的影响，因此效果也不是很理想。利用同位素或生物素标记探针对基因组文库进行杂交筛选的方法，更是费时费力。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、应用范围广、成本低廉、高效准确、pUCm-T载体介导的PCR扩增方法，能够基于已知DNA序列确定其3′端侧翼未知DNA序列。

本发明的内容包括：①选用限制性内切酶双酶切基因组DNA；②纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3′端加A(Adenine)反应，与pUCm-T载体连接；③利用引物设计软件选定T载体上的一段特异性互补序列作为3′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的序列作为5′端引物；④以pUCm-T载体连接物为模板，用设计的引物进行二轮的PCR(巢式PCR)扩增，并对其扩增片段进行克隆和测序。具体步骤如下：

(1)PCR引物的设计：根据已知DNA序列设计两条5′端特异性引物，命名为Primer-F1和Primer-F2(18-22bp)；Primer-F2的3′端距待测序列要保留30bp以上长度，比Primer-F1接近待测的未知序列(图1和图4)；针对本发明引入的pUCm-T载体，在其T/A克隆位点的 下游选定一条3′端特异性引物(20bp，Tm值58℃)，命名为T-PrimerR(图2和图5)。

(2)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从Primer-F1到待测的未知序列之间没有酶切位点的两种限制性内切酶。本发明可供选择常用的产生5′粘性末端的内切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等；产生平齐末端的有EcoRⅤ、SnaBⅠ和ScaⅠ等；产生3′粘性末端的有BmtⅠ、PstⅠ、SacⅠ和KpnⅠ等。

(3)PCR模板的构建：运用步骤(2)选择的两种内切酶对基因组DNA进行双酶切，纯化的酶切产物用Taq酶或Ex Taq酶进行补齐和3′端加A反应，与pUCm-T载体连接，即可作为PCR模板。此步骤若选用的两种内切酶都是5′粘性或平齐末端，只需选用普通Taq酶；否则需要选用带有3′→5′外切酶活性的Ex Taq酶。

(4)巢式PCR扩增：以步骤(3)的pUCm-T连接物为模板，采用Primer-F1和T-PrimerR为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，采用Primer-F2和T-PrimerR为引物进行第二轮PCR扩增。将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR原理可以快速验证其扩增的产物是否为目的片段。

本发明的优点：

本发明使用特异性引物进行巢式PCR扩增，可以确定出已知DNA序列3′端侧翼的未知序列。它与现行的方法相比，具有如下的优点：

1、操作简便。与随机测序法相比，避免了对基因组进行大规模的测序，也无需进行繁琐的计算和排序工作，从而节省了大量的人力、时间和财力。

2、应用范围广。在已知部分DNA序列的基础上，pUCm-T载体介导的PCR扩增可应用于各种不同基因的3′端侧翼未知序列的测定。