[发明专利]一种利用黑曲霉生产壳聚糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用黑曲霉生产壳聚糖酶的方法，具体而言是指利用黑曲霉(Aspergillusniger)LW-1菌株固态发酵生产壳聚糖酶的新工艺，属于生物工程技术领域。

背景技术

壳聚糖是几丁质的脱乙酰基产物，是一种高分子阳离子絮凝剂。壳聚糖经部分降解得到的壳寡糖具有良好的水溶性，易被生物体吸收，且无毒、无热源、无变异性，并具有独特的生理活性，在农业、食品、医药等领域中有着广泛的应用前景。目前，国内外由壳聚糖制备壳寡糖主要有三种方法：酸降解法、氧化降解法和酶解法。其中利用专一性的壳聚糖酶水解壳聚糖，具有反应条件温和、反应过程易控制及对环境无污染等特点，且壳寡糖产量高、质量稳定，是一种较为理想的生产壳寡糖的方法。

壳聚糖酶的分布较广泛，目前已在细菌(Bacillus、Myxobacter、Enterobacter)、放线菌(Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(Aspergillus、Penicillium)、病毒(chlorella virus PBCV-1、CVK-2)和植物的不同组织中检测到壳聚糖酶的存在，并已从发酵液中纯化得到壳聚糖酶。大多数微生物壳聚糖酶是一种诱导酶，在细胞的正常代谢活动中，微量合成或不合成，底物的存在将导致壳聚糖酶的大量合成。陈小娥等报道了摇瓶发酵一株曲霉菌，在粗酶液中检测到壳聚糖酶活性为197U/mL，同时研究了碳源对自筛曲霉突变株(CJ22-326)产酶的影响，发现CJ22-326菌株壳聚糖酶是一种典型的诱导酶，其合成与分泌都需要壳聚糖的诱导，质量分数为2％的壳聚糖起到最佳的诱导效果。孙玉英等报道的Microbacterium sp.OU01菌株产壳聚糖酶活性为118U/mL。余蓉等在发明专利(《壳聚糖酶制备新工艺》，公开号CN1810963A)中报道了利用贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)固态发酵生产壳聚糖酶的新技术，但壳聚糖酶固态发酵酶活性仅为83.1U/g干培养基。综上所述，目前无论是液体发酵或固态发酵，微生物产壳聚糖酶活性均较低，导致了壳聚糖酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用；且未见有利用黑曲霉固态发酵生产壳聚糖酶的文献或专利报道。微生物固态发酵具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低及对环境友好等优势。本发明利用黑曲霉固态发酵生产壳聚糖酶的酶活性高于目前国内水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种以麸皮、玉米粉和豆饼粉等农副产品为发酵基料，利用黑曲霉LW-1固态发酵生产壳聚糖酶的方法。本发明所述固态发酵的技术方案和内容如下：

1.菌株：黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株，由江南大学筛选和保藏，该菌株已于2008年在《农业生物技术学报》杂志的Vol.16 No.2 Pg.346公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。

2.斜面种子培养：去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，pH 6.0；121℃灭菌20min，放置试管斜面；冷却后接种LW-1菌株，30℃培养96h。此斜面培养基可用于菌种的活化、保藏和斜面种子等，每3个月转接1次。

3.麸曲种子制备：250mL三角瓶装10g基料(麸皮10g)，(NH₄)₂SO₄ 100mg，自来水12mL，pH 6.0；充分混匀，121℃灭菌40min；冷却后接种LW-1试管斜面种子，30℃静置培养96h，期间分别于24h和44h各翻曲一次。

4.固态发酵：250mL三角瓶中装10g基料(麸皮8～10g，豆饼粉0～2g，玉米粉0～1g)，(NH₄)₂SO₄ 50～100mg，壳聚糖0～0.3g，MgSO₄ 5～10mg，CaCl₂ 5～10mg，KH₂PO₄ 30～50mg，自来水12～15mL，pH 6.0；充分混匀，121℃灭菌40min；冷却后接种一菌耳LW-1麸曲种子，30℃静置培养84～96h，期间分别于20～24h和40～44h各翻曲一次。

5.粗酶液提取：固态发酵结束后称取发酵曲料1g，加入9mL的pH 5.0、0.05mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，室温浸泡1h，滤纸过滤，所得滤液即为壳聚糖酶液。

6.分析方法：