[发明专利]金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR分型检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR分型检测试剂盒，其特征在于，包括：

(1)扩增反应液成分：

10×Taq DNA Polymerase Buffer、150～250mM dNTP、ddH₂O；

(2)分型反应液A：包含SEA上、下游引物各20uM：

SEA-F：5′-CCGAGTCACGATCAATTTTTACAG-3′

SEA-R：5′-GCGGCTTGTATATAAATATATATCA-3′；

(3)分型反应液B：包含SEB上、下游引物各20uM：

SEB-F：5′-AATCTATAGATCAATTTCTATAC-3′

SEB-R：5′-CTTTTTCTTTGTCGTAAGATA-3′；

(4)分型反应液C：包含SEC上、下游引物各20uM：

SEC-F：5′-GTCTGTAGATAAATTTTTGGCA-3′

SEC-R：5′-TCCATTCTTTGTTGTAAGGTG-3′；

(5)分型反应液E：包含SEE上、下游引物各20uM：

SEE-F：5′-GGCCTATAGATAAAGTTAAAACAAGC-3′

SEE-R：5′-CACCTTACCGCCAAAGCTG-3′；

(6)Taq plus DNA Polymerase：2.5U/ul；

(7)SEA阳性标准品、SEB阳性标准品、SEC阳性标准品、SEE阳性标准品分别为10～200ng/ul的金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因组DNA；

(8)阴性对照品为ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的10×Taq DNAPolymerase Buffer含有200mM pH 8.4的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、200mM氯化钾、100mM硫酸铵、15mM硫酸镁和1％曲拉通X-100。

3.权利要求1或2所述的检测试剂盒用于金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因的分型检测。

4.根据权利要求3所述的检测的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)细菌DNA的提取：细菌待检标本增菌培养后，提取模板DNA；

(2)在PCR反应管中分别加入扩增反应液22.5uL，然后再于相应管中分别加入1uL分型反应液A、分型反应液B、分型反应液C、分型反应液E，然后再于相应管中分别加入1uL待检模板和1.25U Taq plus DNA Polymerase；所述的22.5uL扩增反应液的组成为：2.5uL 10×Taq DNA Polymerase Buffer、2.0uL 250mM dNTP、18uL ddH₂O；

(3)将上述各管混匀后置于PCR仪上进行以下条件的扩增反应：①94℃5min，②94℃30sec，③60℃45sec，④72℃45sec，⑤72℃6min，其中②一④步循环40次；

(4)取扩增产物与上样缓冲液混匀后点样，电泳后放于凝胶成像系统中成像，观察PCR扩增产物有无预期大小的目的DNA片段：金黄色葡萄球菌肠毒素SEA片段为582bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEB片段为602bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEC片段为601bp；金黄色葡萄球菌肠毒素SEE片段为125bp。

5.根据权利要求4所述的检测的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的细菌DNA的提取：待检标本用增菌液增菌培养8-24小时后，取1.0ml培养后的增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA。

6.根据权利要求5所述的检测的方法，其特征在于，所述的增菌液为7.5％的氯化钠肉汤。

7.根据权利要求4所述的检测的方法，其特征在于，步骤(4)点样时，取3ul扩增产物与0.5ul上样缓冲液混匀后点样于含0.8ug/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中，90v电泳30min后放于凝胶成像系统中成像。

8.根据权利要求4所述的检测的方法，其特征在于，步骤(3)所述的PCR反应在同一台PCR仪及同一PCR反应条件下进行。