[发明专利]金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR分型检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测试剂领域，涉及一种利用PCR方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒，以及使用该种试剂盒快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)，是国内外最常见的细菌性食物中毒病原体之一，在引起的中毒暴发事件中，近年来首推2000年“雪印奶粉”事件，14000多人受感染。根据日本卫生部公布的数字，日本20年期间(1980-1999)由金葡菌引起的食物中毒共有2,525次暴发，感染59,964人。该菌引起食物中毒的主要原因是产生葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins，SEs)，根据其血清学特性，SEs可分为5型(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)，其中SEC又分为C₁、C₂、C₃三个亚型。由SED肠毒素引起的食物中毒很少，国内引起食物中毒的金黄色葡萄球菌肠毒素主要是SEA、SEB、SEC、SEE。另外新的SEs也相继发现：SEG，SHE，SEI，SEJ，由该菌引起的食物中毒95％是由SEA-SEE引起。

对于SEs的检测及鉴定主要依赖免疫学技术，其中最常用的是反相间接血凝法(RPHA)和酶联免疫吸附试验，但由于此方法检测的是金黄色葡萄球菌产肠毒素的表现型，有些菌株虽然有产毒基因，但受培养等条件影响，其特异性和敏感性较差，故此不能满足公共卫生检测的需要。而PCR技术检测的是肠毒素的基因型，不会受培养等条件的影响而出现假阴性，这对食物中毒病原体——金黄色葡萄球菌SEs的检测和流行病学调查是具有重要意义的。

随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌PR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法，结果表明，该方法敏感、准确、快速，特别适合病原微生物的检测。但是目前未有利用PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒及方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高且成本低的基于PCR的金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型检测试剂盒，并提供使用该种试剂盒快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE基因的方法，从而为传染病的监测和食品安全提供一种有益的检测手段。

本发明涉及一种利用PCR方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的基因分型检测试剂盒，其试剂包括：

(1)扩增反应液成分：

10×Taq DNA Polymerase Buffer、150-250mM dNTP、ddH₂O；

其中10×Taq DNA Polymerase Buffer含有200mM pH 8.4的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、200mM氯化钾、100mM硫酸铵、15mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；

(2)分型反应液A：包含SEA上、下游引物各20uM：

SEA-F：5′-CCGAGTCACGATCAATTTTTACAG-3′

SEA-R：5′-GCGGCTTGTATATAAATATATATCA-3′；

(3)分型反应液B：包含SEB上、下游引物各20uM：

SEB-F：5′-AATCTATAGATCAATTTCTATAC-3′

SEB-R：5′-CTTTTTCTTTGTCGTAAGATA-3′；

(4)分型反应液C：包含SEC上、下游引物各20uM：

SEC-F：5′-GTCTGTAGATAAATTTTTGGCA-3′

SEC-R：5′-TCCATTCTTTGTTGTAAGGTG-3′；

(5)分型反应液E：包含SEE上、下游引物各20uM：

SEE-F：5′-GGCCTATAGATAAAGTTAAAACAAGC-3′

SEE-R ：5′-CACCTTACCGCCAAAGCTG-3′；

(6)Taq plus DNA Polymerase：2.5U/ul；