[发明专利]融合表达重组制备T4核酸内切酶V

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术和药物领域，涉及通过融合表达的重组T4N5，含编码该融合蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用于基因工程制备该蛋白的方法，以及该蛋白在治疗疾病领域的应用。

背景技术

长期暴露于紫外线是皮肤癌(非黑色素性)的重要发病原因，实验表明：皮肤角朊细胞DNA的嘧啶碱基可吸收紫外线产生环丁烷嘧啶二聚体(5，6-Cyclobutyl dipycimidines，CPD)，造成DNA损伤。DNA损伤后细胞发生有丝分裂增殖时经常发生突变，从而导致细胞衰老、癌变。因此防止紫外线辐射引起皮肤病变，对DNA的防护和修复就显得尤为重要。

T4核酸内切酶V(T4endonuclease V，简称T4N5)是噬菌体T4感染宿主E.coli后由基因DenV表达的一种修复酶，分子量约16000道尔顿。它能特异性地识别CPD，并在该损失部位切断磷酸二酯键，从而启动体内的DNA切除修复途径。T4N5通过两种酶活的作用方式完成对CPD位点的切割：第一步是通过PD-DNA糖苷酶活力切割PD中的5’嘧啶与其脱氧核糖间的N-糖苷键形成一个脱嘧啶(AP)位点；第二步由AP内切酶活力在所产生AP位点的3’端切断磷酸二酯键，形成具有5-P，3’-OH末端的单链缺刻。T4N5作用范围不限于噬菌体和E.coli的DNA，在细胞内外它也能作用于各种DNA，且特异性强，只针对被紫外损伤的DNA有修复作用，对正常DNA无任何切割作用。近年来，国际上已有大公司将T4N5开发成护肤品成分和药品。美国TPSG公司将T4N5包埋于脂质体中，作为护肤产品的主要成分；美国AGI公司开发的T4N5脂质体药品已在皮肤癌的预防和治疗中进入III期临床试验。

国内外均有报道T4N5的基因工程制备，其工艺主要包括：1、用基因克隆方法，将T4N5基因构建到重组质粒，再将该重组质粒转入表达菌株；2、筛选高表达工程菌株，诱导表达；3、收集菌体破菌，离心去除沉淀，上清分别经过离子柱、疏水柱、DNA亲合柱等层析，获得纯品。

Yusaku Nakabeppu等(THE JOURNAOLF BIOLOGICALC HEMISTRY，Vol.257，No.5，Issueof March 10，Pages 2556-2562，1982)经过抽提、萃取、CM Sephadex层析、Bio-Gel-P-10层析、Phosphocellulose层析、单链DNA亲合柱层析，获得的T4N5工艺复杂且酶比活性低。K.M.Higgins等(Mutation Research/DNA Repair Reports，Volume 183，Issue 2，March1987，Pages 117-121)通过破菌、单链DNA亲合柱层析、Pharmacia PBE94层析、CM Sephadex层析虽可获得较高纯度的T4N5，但回收率低，工艺无法放大。两者采用分泌型可溶性表达T4N5，但表达量仅为1％左右。Carol ina Alvarez Roger等(Journal of Dermatological Science(2005)39，81-88)经过破菌、复性、DEAE层析、单链DNA亲合柱层析，可获得一定量的T4N5。但由于T4N5为包涵体表达，工艺中需要变性、复性步骤，而复性的T4N5存在一定量的非活性形式，并难以有效控制变性过程。已报道的T4N5纯化工艺中均采用了单链DNA亲和柱层析，该方法成本高，限制了T4N5的规模化制备。

T4N5的体外活性检测采用DNA缺刻法，其原理是利用被紫外线照射的质粒DNA的三种不同构型在琼脂糖凝胶电泳中迁移率不同达到测活的目的。T4N5在I型DNA的CPD位点造成一个缺口后，I型DNA即转变成迁移率更低的II型质粒DNA，如果在互补双链上相距很近的CPD位点均造成缺口，II型DNA转变成迁移率更低的III型DNA，通过观察电泳结果中三种DNA的分布，即可获得酶活力的定性结果，计算I型DNA减少的量，可获得酶活力的定量结果。1个国际活性单位定义为20μl反应体系中，37℃条件下，30分钟内使大于95％的1ng经紫外线照射的超螺旋PBR322DNA变成切刻型质粒的酶量。

发明内容