[发明专利]农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法。

背景技术

1984年，大豆的遗传转化研究首次被报道，并且证明农杆菌介导的不同作物之间的DNA转化是可靠而高效的。1988年，Hinchee等从100多份材料中筛选出对农杆菌敏感的大豆品种，以其子叶为受体材料，首次获得了大豆转基因植株(参考文献：Hinchee M AW，Connor-Ward DV，Newell C A，McDonnell R E，Sato S J，Gasser C S，FischhoffD A，Re D B，Fraley R T，Horsch RB.Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer.Biotechnology，1988，6：915-922)。该研究直接证明了农杆菌可以介导大豆的遗传转化，这是遗传工程应用于大豆改良上的一个里程碑。已报导的大豆遗传转化体系包括农杆菌介导法、花粉管通法、基因枪及PEG法等。农杆菌介导的转基因方法操作简便，成本低，是目前应用最广泛的一种方法。它是以大豆的子叶、子叶节、胚轴为外植体，通过抗生素筛选，器官发生再生转化植株。其中以子叶节为外植体的转化体系，即大豆子叶节转化体系由于具有组织培养时间较短，不易产生体细胞突变体和不育的植株；培育出的转基因植株具有较少的外源基因拷贝，遗传行为上较为简单稳定等优点，运用更为普遍。

长期以来，在以植物组织培养为基础的基因转化过程中，由于受基因型限制，以及受体系统不完善、大豆对农杆菌不敏感等原因，使转化的最佳条件难以确定，使农杆菌介导的大豆遗传转化频率低，实验结果重复性差。大豆一直被公认为难转化的作物之一，严重制约着基因工程技术在大豆遗传改良中的应用。在过去的几十年里，大豆的转化研究工作主要集中在通过利用GUS等报告基因优化转化方法，建立高效率的大豆遗传转化及再生体系，但结果都不十分理想，仍存在遗传转化率较低的问题，如刘栋等选用‘科丰6号’和‘合丰35’得到的GUS瞬时表达率分别为52.2％和54.5％(参考文献：刘栋，石强，李鹏丽，王宁宁.利用GUS基因瞬时表达对大豆子叶节和胚尖转化方法的比较及优化.生物学通报，2008，43(12)：35-39)。李文霞等对农杆菌介导的大豆子叶节转化系统优化的研究中发现‘黑农35’子叶节区GUS阳性率最高，为63.3％(参考文献：李文霞，宁海龙，吕文河，李文滨.农杆菌介导的大豆子叶节转化系统优化.中国农业科学，2008，41(4)：971-977)，而本发明所使用的涂抹法，GUS染色率可高达93.18％，与传统的大豆子叶节遗传转化方法相比大大提高了农杆菌的转化效率。

发明内容

本发明为解决农杆菌遗传转化大豆子叶节转化率低的问题，提供一种新型、高效的农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，大大简化了遗传转化步骤。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

农杆菌遗传转化大豆子叶节的方法，包括大豆子叶节的外植体的获得、农杆菌的活化、遗传转化、共培养步骤，所述的农杆菌含有携带报告基因和/或外源基因的质粒，所述的遗传转化是用无菌棉棒蘸取经活化的所述的农杆菌涂抹于所述的外植体子叶节部位。

所述的含子叶节的外植体通过如下方法获得：取发育饱满无病害的大豆种子，消毒后将种子在无菌水中浸泡30～60min后接种于B₅培养基，培养5-7d，获得无菌苗；取子叶未完全展开的无菌苗，剥去种皮，切去根和大部分下胚轴，保留3-5mm的下胚轴，沿种子中线切开，分离两片子叶，切除顶芽及初生芽。

所述的大豆种子消毒方法为取发育饱满无病害的大豆种子，70％乙醇浸泡30s表面消毒，无菌水冲洗2次；0.1％升汞消毒10min，无菌水冲洗5～6次，每次4～5min。

所述的共培养是将遗传转化步骤获得的涂抹了农杆菌的外植体插入共培养培养基，黑暗中共培养3-3.5d。

所述的共培养培养基组成为B₅基本培养基+1mM硫代硫酸钠+1mM半胱氨酸+3％蔗糖+1mM二硫苏糖醇+200μmol·L^-1乙酰丁香酮+1.67mg·L^-16-BA+0.25mg·L^-1赤霉素，pH5.4，+0.7％琼脂。上述浓度均为各物质在共培养基中的终浓度。

所述的农杆菌为LBA4404、EHA101或KYRT1，优选LBA4404。

所述的报告基因为GUS基因。