[发明专利]半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒

权利要求书

1.半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于包括以下步骤制备而成：

根据马铃薯X病毒全基因组中外壳蛋白基因序列保守区，设计三条引物和一条TaqMan探针；

(1)从植物叶片中提取总RNA并测定其OD值；

(2)将提取的植物总RNA反转录合成cDNA；

(3)实时荧光PCR检测，包括引物探针的特异性检测和灵敏度检测。

2.根据权利要求1所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的特异性检测方法为：从感染PVX病毒的植物叶片以及其它相应的对照植物叶片中提取总RNA，将提取的植物总RNA进行反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行引物探针特异性实时荧光PCR试验；

3.根据权利要求1所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的灵敏度检测方法为：将上述步骤(2)中提取的感染马铃薯X病毒的植物叶片总RNA进行梯度稀释，并分别反转录合成cDNA，然后进行实时荧光PCR检验。

4.根据权利要求1所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的三条引物和一条TaqMan探针，其中一条上游引物序列为：5’-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3’；另一条上游引物序列为：5’-GGCCAGGGCACAATCCA-3’；下游引物序列为：5’-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3’；探针序列为：5’(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG-3’(TAMRA)。

5.根据权利要求1所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的反转录合成cDNA的方法为：在反应体系中加入缓冲液、反转录酶及其缓冲液、随机引物、和植物总RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反应条件为：37℃、15分钟，85℃、5秒，合成cDNA。

6.根据权利要求5所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的缓冲液为5 PrimeScript^TM Buffer，缓冲液中含有四种dNTP混合物和Mg²⁺；所述的反转录酶及其缓冲液为PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I，所述的随机引物为Oligo dT Primer和Random 6 mers。

7.根据权利要求1所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的特异性检测，反应体系为分别加入PCR SuperMix-UDG、荧光染料、上游引物、下游引物、探针和cDNA，补充DEPC水定容；循环条件依次为：45-55℃、1-3min；90-100℃、1-3min；90-100℃、10-20s；55-65℃、25-35s。

8.根据权利要求7所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的PCR SuperMix-UDG为定量PCR SuperMix-UDG，主要包括Taq DNA聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgCl2、400μM dGTP、400μM dATP、400μM dCTP、800μM dUTP、尿嘧啶DNA转葡糖基酶以及稳定剂。

9.根据权利要求7所述的半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于所述的循环条件依次为：50℃、2分钟；95℃、2分钟；95℃、15秒，60℃、30秒，45个循环。