[发明专利]半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒的检测方法，具体地说是半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，属于植物病毒检测领域。 

背景技术

马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)是马铃薯上最为重要的病害之一，严重感病的马铃薯能减产80％以上。马铃薯X病毒粒子为弯曲状，长470-580nm，直径13nm，螺旋对称结构，为单链RNA病毒。马铃薯X病毒通常具有中等致病性，引起许多单子叶植物和双子叶植物的系统花叶和环斑症状。在自然条件通过机械接触传播，无已知介体，该病毒容易通过人工接种传播。单一病毒的寄主范围较窄，马铃薯X病毒仅限于浸染茄科植物。虽然是马铃薯X病毒单一浸染时症状比较轻微或在温度过高、过低或高肥水条件下极易隐症，但是当该病毒与其它能协生的病毒复合感染抗耐病差的马铃薯品种时，常导致严重减产现象，甚至达80％以上。因此，马铃薯X病毒是造成马铃薯病毒性退化的主要病毒之一。 

目前，检测马铃薯X病毒的方法主要有鉴别寄主接种法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、RT-PCR技术等。电镜技术设备昂贵，检测灵敏度低；ELISA技术操作步骤繁琐、检测周期长、灵敏度低、易出现假阳性；PCR凝胶电泳技术较ELISA在多个方面有所提高，但易于造成污染；未见采用实时荧光PCR检测PVX的研究所道。 

发明内容

本发明的目的在于，针对上述问题，提出根据PVX外壳蛋白(CP)基因的保守序列，设计并合成了三条巢式PCR引物和一条TaqMan荧光探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR检测PVX的新方法。该方法有机了结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术：在实时荧光PCR引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物；反链引物分别与两条正链引物配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。实时荧光PCR技术采用TaqMan荧光探针信号放大的功能有效提高了检测的灵敏度；三条引物形成的两套PCR体系进行相互验证，极大地提高了检测的准确性；全封闭的操作系统减少了污染，PCR结果的实时观察极大缩短了检测周期。该方法检测的准确性、灵敏度等比巢式PCR、Real-time PCR及其它方法高。 

本发明的技术方案为： 

半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，包括以下步骤制备而成： 

(1)TaqMAN探针与引物的设计合成，根据核酸数据库中PVX全基因组中CP基因序列保守区，设计三条引物和一条TaqMan探针； 

(2)总RNA提取及质量控制，从植物叶片中提取总RNA，测定其OD值； 

(3)反转录合成cDNA，将提取的植物总RNA进行反转录合成cDNA； 

(4)实时荧光PCR检测，包括特异性检测和灵敏度检测； 

所述的特异性检测方法为：从感染PVX病毒及其它的对照植物叶片中提取总RNA，将提取的植物总RNA分别进行反转录合成特异性模板cDNA，将合成的cDNA进行引物探针特异实时荧光PCR试验； 

所述的灵敏度检测方法为：将上述步骤(2)中提取的感染马铃薯X病毒的植物叶片总RNA梯度稀释，并分别进行反转录合成cDNA，然后进行实时荧光PCR检验。 

所述的三条引物和一条TaqMan探针序列分别为：一条上游引物序列为：5’-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3’；另一条上游引物序列为：5’-GGCCAGGGCACAATCCA-3’；下游引物序列为：5’-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3’；探针序列为：5’(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG-3’(TAMRA)。 

所述的反转录合成cDNA的方法为：在反应体系中加入缓冲液、反转录酶及其缓冲液、随机引物、和植物总RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反应条件为：37℃、15分钟，85℃、5秒，合成cDNA。 

所述的缓冲液为5 PrimeScript^TM Buffer，缓冲液中含有四种dNTP混合物和Mg²⁺；所述的反转录酶及其缓冲液为PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I，所述的随机引物为Oligo dT Primer和Random 6 mers。