[发明专利]一种皇佳吉鸡品种的分子生物学鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物品种鉴定技术领域，具体涉及一种皇佳吉鸡品种的分子生物学鉴定方法。

背景技术

皇佳吉鸡是现代新农业股份有限公司最新培育的优质新型肉鸡品种，因其肉质鲜香、味醇、汁多，受到了消费者的广泛亲睐。但市场上一些不法企业、养殖户非法生产和销售假冒、仿冒皇佳吉鸡的现象屡见不鲜，严重损害了皇佳吉鸡品牌的声誉，影响了现代新农业股份有限公司的发展。目前对家禽品种的鉴定主要是以形态学标记为依据来审查育种档案和生产性能测定。但随着育种技术的不断成熟，亲本与杂交后代的外貌特征有较大的相似性，很难从外貌特征进行区分。所以利用形态学标记来进行家禽品种(品系)鉴定就不够科学、准确。如果进行生产性能测定，不仅耗费大量的人力、时间和高昂的性能测定费用，而且性能测定的结果还受饲养各个环节因素的影响，因此生产性能测定也难以准确反映各品种(品系)的真实的生产性能和种质特性。基于基因克隆和DNA测序技术发展的DNA分子标记能够准确的揭示品种之间最根本的遗传差异(碱基差异)。线粒体DNA分子标记就属于这类标记特别是COI(细胞色素C氧化酶亚基I)基因，它具有遗传自主性、严格的母系遗传、拷贝数高、无组织特异性、进化速度快等特点，已经广泛应用于鲸、人类、鸟类等群体鉴定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种准确性高，鉴定时间短，成本低的皇佳吉鸡品种的分子生物学鉴定方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种皇佳吉鸡品种的分子生物学鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)通过苯酚-氯仿法分别提取皇佳吉鸡和受测鸡包括线粒体DNA的总DNA；

(2)按照GeneBank上发表的红色原鸡线粒体DNA的COI基因序列(AP003322)和丝羽乌骨鸡线粒体DNA的COI基因序列(AB086102)设计三对引物PF1(SEQ ID NO.3)和PR1(SEQ ID NO.4)，PF2(SEQ IDNO.5)和PR2(SEQ ID NO.6)，PF3(SEQ ID NO.7)和PR3(SEQ ID NO.8)；所述引物的序列分别为：

上游引物PF1：5’-TACAGCCTAACGCTTCAACA-3’；

下游引物PR1：5’-GGTTGCGGTCGGTAAGTAGT-3’。

上游引物PF2：5’-GCCCATGCTTTCGTCATAA-3’；

下游引物PR2：5’-TGGGATGGCGATGATTATTG-3’。

上游引物PF3：5’-CGCCATCCCAACTGGTAT-3’；

下游引物PR3：5’-GATGAGGCGTCTTGAAAG-3’。

(3)利用步骤(2)中所述引物对皇佳吉鸡线粒体DNA的COI基因进行PCR扩增，将扩增的产物克隆并在DNA测序仪上进行测序获得皇佳吉鸡线粒体DNA的COI基因的全序列(SEQ ID NO.1)；

(4)根据步骤(3)中测得的皇佳吉鸡线粒体DNA的COI基因的全序列设计引物PF(SEQ ID NO.9)和PR(SEQ ID NO.10)；所述引物的序列为：

上游引物PF：5’-GCACAGGATGGACAGTTTAC-3’；

下游引物PR：5’-ATAGCATAGGGGGGTCTCAT-3’。

利用所述引物获取可用于品种鉴定的皇佳吉鸡COI基因中的一段基因序列(SEQ ID NO.2)，进行测序，并通过Chromas1.49软件准确读取测序结果；

(5)利用步骤(4)中所述引物获取受测鸡与步骤(4)中测得的皇佳吉鸡COI基因中的一段基因序列(SEQ ID NO.2)相应的基因序列，进行测序，并通过Chromas1.49软件准确读取测序结果；

(6)将步骤(4)获得的测序结果和步骤(5)获得的测序结果进行人工逐碱基读取和核对；

(7)通过DnaSP4.10.7软件统计皇佳吉鸡和受测鸡的变异位点、单倍型、平均核苷酸差异、核苷酸分歧度和净遗传距离，并根据皇佳吉鸡和受测鸡的变异位点、单倍型、平均核苷酸差异、核苷酸分歧度和净遗传距离，确定皇佳吉鸡和受测鸡基因序列的平均变异程度，平均变异程度不大于2％则为同一品种，平均变异程度大于2％则为不同品种；