[发明专利]一种耐高温植酸酶基因工程菌的发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵领域，具体涉及一种耐高温植酸酶基因工程菌的发酵方法。

背景技术

单胃动物缺乏从植酸分子水解释放无机磷的消化酶，占动物日粮总磷50~70%的植物磷无法被充分利用，排放到自然界造成土地和水资源的磷生态负担日益严重；植酸盐通过螯合作用可降低动物对锌、锰、铁、钙、钾等主要微量元素的利用率；通过与蛋白质结合成植酸复合物而降低动物对蛋白质的消化吸收率，从而降低饲料利用率。植酸酶（phytase）是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸（或盐）的一类酶的总称，研究表明，在猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%，从而减少饲料中磷的添加量，同时可降解植酸盐的抗营养作用。作为一种新型饲料添加剂，无论在动物生产还是环境保护中，植酸酶都有重要的应用价值。植酸酶在动物、植物及微生物中均有发现，然而真正具有开发价值的仅限于利用微生物发酵生产的植酸酶。国内对植酸酶的研究起步较晚，目前市场上应用的优质植酸酶制剂多属进口产品，且价格昂贵。饲用植酸酶应具备热稳定性好、抗蛋白酶特性强、广泛的底物特异性及在动物胃肠pH条件下的高酶活性等，这也正是植酸酶研究的热点，特别是植酸酶的热稳定性是国内外研究者一致要攻克的瓶颈。筛选耐热性更好的植酸酶以及利用基因工程来改善植酸酶的性质，探索更好的提高植酸酶的热稳定性的方法仍是研究的重点。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的植酸酶热稳定性的不足，提供一种耐高温的植酸酶基因工程菌的发酵方法，以实现耐高温植酸酶的市场化。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种植酸酶基因工程菌的发酵方法，包括如下步骤：

（1）植酸酶基因工程菌高密度培养阶段：将植酸酶基因工程菌种子接种于发酵罐中培养，待初始葡萄糖耗尽后，DO值迅速回升时，补充碳源直至高密度培养阶段结束；

（2）诱导表达：用甲醇诱导表达植酸酶后结束发酵；

（3）分离纯化。

作为一种优选方案，步骤（1）中所述碳源为葡萄糖；补料方式为分批补料、恒溶氧流加。

作为一种优选方案，步骤（1）中溶氧维持在20~50%；步骤（2）中的诱导表达溶氧维持在10%。

作为一种优选方案，步骤（1）中所述补充碳源的时间是在发酵16h后。

作为一种优选方案，步骤（2）中所述甲醇的流速为8mL/L/h。

作为一种优选方案，步骤（1）中所述培养时间为48h。

作为一种优选方案，步骤（1）中的培养中，pH值调节在5.5。

作为一种优选方案，步骤（2）中所述诱导表达的时间为72h。

作为一种优选方案，步骤（3）中所述分离纯化是：离心得粗酶液，用丙酮沉淀和离子交换层析对粗酶液进行纯化，丙酮浓度为65%，离子交换层析柱pH为5.5。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明适用于5000L发酵罐进行中试发酵，实现了生产水平上的发酵放大，且工艺稳定，产物表达量是非高密度发酵的近20倍；

2、通过本发明获得的耐高温植酸酶，90℃下保温20min后残留酶活在69%以上，可以满足饲料高温制粒的要求，且优于市场产品；

3、本发明建立的植酸酶分离纯化方法，步骤简单，且回收率高，达50%以上。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例

（1）耐高温植酸酶基因工程菌高密度培养阶段

 以10%的接种量将植酸酶基因工程菌种子接种于5000L全自动发酵罐中，培养温度30℃，用14%氨水调pH至5.5，调节转速、通风量来控制溶氧大于20%；发酵培养16h后，溶氧迅速回升，此时开始以恒溶氧方式补加碳源葡萄糖，培养32h补料结束。

（2）甲醇诱导表达耐高温植酸酶

植酸酶基因工程菌高密度培养结束，碳源葡萄糖耗尽，溶氧上升，开始以8mL/L/h流加甲醇进行诱导表达植酸酶，同时pH用浓氨水调至pH6.0，通过调节转速、通风量等使溶氧维持在10%左右，诱导表达72h，植酸酶酶活达到6000IU/mL以上。

（3）耐高温植酸酶的分离纯化

发酵结束后，发酵液经离心得粗酶液，采用丙酮沉淀和Sepharose离子交换层析对粗酶液进行纯化，丙酮浓度为65%，离子交换层析上柱pH为5.5，植酸酶酶活回收率达50%以上；经浓缩即可获得目的表达产物植酸酶。

通过本发明获得的耐高温植酸酶，90℃下保温20min后残留酶活在69%以上。