[发明专利]将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法

权利要求书

1.将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，是一种利用多种抗性基因筛选重组菌，将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一整合位点的方法，具体步骤是：

1)将外源基因表达单元分别单独克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，每一个重组整合质粒携带一个外源基因表达单元；

2)第一个外源基因表达单元的整合是利用整合质粒将外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中，通过整合质粒上携带的抗性基因筛选标记A挑选得到外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌1；

3)用替换抗性基因筛选标记的质粒将上述重组枯草芽孢杆菌1的抗性基因筛选标记A替换为抗性基因筛选标记B，通过抗性基因筛选标记B将替换成功的重组菌挑选出来，得到带抗性基因筛选标记B的重组枯草芽孢杆菌2；

4)第二个外源基因表达单元的整合是利用连接有第二个外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式将第二个外源基因表达单元整合到重组枯草芽孢杆菌2上，通过抗性基因筛选标记A和抗性基因筛选标记B筛选得到含有两个外源基因表达单元的重组枯草芽孢杆菌；

5)重复上述步骤3)和步骤4)，将抗性基因筛选标记A替换为其他抗性基因筛选标记后，用连接有外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式整合到重组菌中，可以得到两个以上表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌；

所述的外源基因表达单元可以相同或不同：如不同，得到不同外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；如相同，得到两个或两个以上拷贝的外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌；

所述的外源基因表达单元可以是单顺反子，也可以是多顺反子；

所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168衍生菌株。

2.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒pMLK83及其衍生质粒或pDK及其衍生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为新霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为pVK71；所述的抗性基因筛选标记B为状观霉素。

3.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒pDG364及其衍生质粒或pDL及其衍生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为氯霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为JM103(pCm::Er)、JM103(pCm::Nm)、JM103(pCm::Sp)、JM103(pCm::Tc)；所述的抗性基因筛选标记B为红霉素、新霉素、状观霉素或四环素。

4.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒pDG1661及其衍生质粒或pDG1662及其衍生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为氯霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为JM103(pCm::Er)、JM103(pCm::Nm)、JM103(pCm::Tc)；所述的抗性基因筛选标记B为红霉素、新霉素或四环素。

5.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒pDG1663及其衍生质粒或pDG1664及其衍生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为红霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为JM103(pEr::Cm)、JM103(pEr::Nm)、JM103(pEr::Pm)；所述的抗性基因筛选标记B为氯霉素、新霉素或腐草霉素。

6.根据权利要求1所述将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为能与枯草芽孢杆菌染色体基因组发生同源交换的质粒pSG1154、pSG1190、pSG1191、pSG1192、pSG1193或pSG1729及它们相对应的衍生质粒；所述的抗性基因筛选标记A为状观霉素；所述的替换抗性基因筛选标记的质粒为pVK73；所述的抗性基因筛选标记B为新霉素。