[发明专利]将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是非致病的，不产毒素和致热致敏蛋白质，是一种食品安全的菌种，被归为食品级微生物范畴。而且枯草芽孢杆菌作为表达系统，具有以下优点：1.具有很强的蛋白质分泌功能，不需要破碎细胞来提取蛋白质，只需要较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质，目前已有多种外源蛋白在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达。2.没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包函体。3.发酵条件简单。开发利用枯草芽孢杆菌作为表达系统具有深远的意义。

根据所采用载体的类型不同，枯草芽孢杆菌表达模式可分为染色体整合表达和可复制质粒表达两种。在染色体整合表达中外源基因在宿主中可保持较好的稳定性，而复制质粒通常不稳定，需加抗生素来维持。但是抗生素在食品及其添加剂生产中是不能添加的。因此，枯草芽孢杆菌染色体整合表达是食品、药品生产未来发展的一个趋势。整合表达的一个不足在于需表达基因的拷贝数低，从而影响外源蛋白的表达量。增加拷贝数的一种方法是将外源基因分别整合在不同的位点。这种方法需要将外源基因克隆到不同的整合载体上，而且外源基因在染色体不同的整合位点表达水平也可能不一样。另一种方法是通过不 断提高抗生素的浓度，筛选出整合拷贝数增加的重组子。这种方法利用抗生素浓度增加的数量性状来筛选重组子，假阳性高，获得的整合菌株中的多拷贝外源基因不稳定，外源蛋白的表达效果也不理想，往往需要高浓度的抗生素来维持外源基因的拷贝数。

发明内容

本发明的目的是提供一种方法，将两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体同一个整合位点。通过提高表达单元的拷贝数，以期获得更高的外源基因表达量。本发明是将整合质粒整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组，利用整合质粒的抗性基因筛选标记筛选出重组菌，再用替换抗性基因筛选标记的质粒替换抗性基因筛选标记，整合质粒再转化得到的重组菌，再通过整合质粒上的抗性基因筛选标记和替换抗性基因筛选标记质粒的抗性基因筛选标记筛选获得重组菌。经过若干轮整合-替换-再整合，可以获得两个或两个以上外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组的重组菌。

本发明用到的整合质粒pDG364、pMLK83、pDG1661、pDG1662、pDG1663、pDG1664、pDG1728、pDG11729、pDG1730、pDG1731、pAX01、pAX-spac、pSG1154、pSG1192、pSG1193、pSG1729、pSG1190、pSG1191、pDL、pDK，及替换抗性基因筛选标记质粒pVK71、pVK73、JM103(pCm::Er)、JM103(pCm::Nm)、JM103(pCm::Sp)、JM103(pCm::Tc)、JM103(pEr::Cm)、JM103(pEr::Nm)、JM103(pEr::Pm)、JM103(pEr::Sp)均购自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(the Bacillus Genetic Stock Center，BGSC，http://www.bgsc.org)。

本发明通过以下步骤实现：

1)将外源基因表达单元分别单独克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，每一个 重组整合质粒携带一个外源基因表达单元；

2)第一个外源基因表达单元的整合是利用整合质粒将外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中，通过整合质粒上携带的抗性基因筛选标记A挑选得到外源基因表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌1；

3)用替换抗性基因筛选标记的质粒将上述重组枯草芽孢杆菌1的抗性基因筛选标记A替换为抗性基因筛选标记B，通过抗性基因筛选标记B将替换成功的重组菌挑选出来，得到带抗性基因筛选标记B的重组枯草芽孢杆菌2；

4)第二个外源基因表达单元的整合是利用连接有第二个外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式将第二个外源基因表达单元整合到重组枯草芽孢杆菌2上，通过抗性基因筛选标记A和抗性基因筛选标记B筛选得到含有两个外源基因表达单元的重组枯草芽孢杆菌；

5)重复上述步骤3)和步骤4)，将抗性基因筛选标记A替换为其他抗性基因筛选标记后，用连接有外源基因表达单元的整合质粒以同源单交换形式整合到重组菌中，可以得到两个以上表达单元整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌；