[发明专利]纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种纯烟叶浸提液固体平板高温分离烟叶表面微生物的方法，属于应用微生物技术领域。

背景技术

微生物分离方法是获得纯培养微生物的重要技术。微生物的分离方法通常包括培养基组成和分离培养温度。按凝固剂含量的多少将培养基分为固体、半固体和液体培养基。分离温度也按培养温度的高低分为低温、中温和高温。随着烟草工业的发展，微生物技术在烟草行业的应用已十分广泛。微生物应用技术渗透到烟草农业栽培过程、烟叶醇化增香等卷烟工业的前期工艺过程。

据不完全统计，迄今从烟叶中分离到的可培养，能改善烟叶品质的微生物有：奇异产碱菌(Alcaligenes paradoxus Uchida&Maeda，1976)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformilsUchida&Maeda，1976)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae Giovannozzi，1959)、噬烟碱节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans R.Brandsch，2001)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans Izquierdo T.A.，1982；Caponigro V.，1979)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium王革，2003)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides王革，2003)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus王革，2003)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis王革，2003专利)、纤维单胞菌(Cellulomonas sp.Lawrence E.Gravely，1978)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.Giovannozzi，1957；Izquierdo T.A.，1982)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae Gutierrez R.，1983)、烟草微球菌(Micrococcus nicotianaeGiovannozzi，1947)、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.Wada E.，1958；Izquierdo T.A.，1982)、烟草假单胞菌(Pseudomonas nicotianae孙君社，2004)、恶臭假单胞杆菌(Pseudomonasputida Edwards W.B.，1983；Civilini，Metal，1997)、烟草德巴利菌(Debaryomycesnicotianae Giovannozzi，1947)、刺孢小克汗霉菌(Cunninghamella echinulata Uchida S.et al，1983)、丝核薄膜草菌(Pellicularia filamentosa Uchida S.et al，1983)、酵母(Yeast C.Enders，1947)、黄色闫氏菌(Yania flava Dino Parente et al，2007)。前人虽然已应用不同培养基和培养分离技术从烟叶表面分离到大量微生物类群。但在烟叶表面微生物的分离方法中，培养基成分通常是由牛肉膏、蛋白胨等营养物质和氯化钠等无机盐和水组成，使用烟叶浸提液只是作为附加成分之一，培养温度通常是28℃左右。

虽然实验表明使用酶制剂能够获得改善烘烤烟叶品质的结果，并且具有作用点单一、作用浓度容易控制的优点，但是在烘烤阶段使用酶制剂也存在一些问题。首先，目前市面上的商品酶多半是常温酶，温度耐受较差，不适合在烘烤条件下应用。其次，一般高温酶市场价格比较昂贵，应用成本太高，经济上不合算。再者，从本质上看，酶也是一种蛋白质，对于蛋白质含量本来就高的上部烟叶再添加蛋白质，没有道理。从实际情况看，鲜烟叶是一个微生物生存竞争十分激烈的环境，酶的加入可能充其量也是作为某些微生物的营养成分被利用。

烟草调制是烟叶采收后的一个重要加工环节，其可控性非常强，对利用微生物改进提高烟叶品质非常有利。醇化烟叶中微生物资源丰富，代谢功能复杂多样，而且易于培养再生，因此，使用不同分离方法，筛选开发利用对烟草品质有利的微生物具有很大的应用前景。

发明内容

本发明目的在于发明一种不添加任何附加成分，直接用纯烟叶浸提液(10％±5％，W/W)的固体培养基，在50℃-60℃培养温度下，分离筛选得到烟叶中本身自带的、具有活性的高温菌株——YN114、YN105、YN91，YN114等菌株，使用这些菌株可生产微生物制剂。