[发明专利]甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法

权利要求书

1.甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，

（1）分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物CSV 1和CSV 2；甘薯羽状斑驳病毒的引物FMV 1和FMV 2；甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物FMVCH，甘薯羽状斑驳病毒CH2株系的上游引物FMVCH2，所述引物序列为：

CSV 1：5＇-AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3＇，       

CSV 2：5＇-GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3＇，

FMV 1：5＇-GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3＇，

FMV 2：5＇-GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3＇，

FMVCH：5＇-GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3＇，

FMVCH2：5＇- CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3＇，

其中Y为C或T，D为G、A或T，R为A或G，M为A或C；

（2）提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

 （3）将所述CSV 1、CSV 2、FMV 1、FMV 2、FMVCH和FMVCH2引物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；

（4）用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述反转录时的反应体系为10μl，包括：2μl 5×RT buffer，1μl 浓度为25mmol/L的MgCl₂，1μl浓度各为10mmol/L的 dNTP混合物，CSV 2引物0.5μl，FMV 2引物0.5μl，0.25μl浓度为40U/μl的抑制剂，0.5μl浓度为5U/μl的反转录酶，4.25μl 甘薯叶片的总RNA；所述CSV 2、FMV 2引物浓度均为10μmol/L。

3.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为25μl，包括：2.5μl 10×PCR buffer，0.3μl浓度为5U/μl 的Taq 酶，2μl浓度各为2.5mmol/L的 dNTP混合物，1.3μl 浓度为25mmol/L 的 MgCl₂溶液，CSV 1引物0.5μl、CSV 2引物0.5μl、FMV 1引物0.2μl、FMV2引物1.3μl、FMVCH引物0.3μl、FMVCH2引物0.5μl，所述引物浓度均为10μmol/L，用2μl反转录产物作模板，用DEPC- H₂O 补足至25μl。

4.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述反转录时反应程序为：42℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min，反应后得到反转录产物。

5.根据权利要求1所述的多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸40s, 30个循环，最后72℃ 延伸10min。