[发明专利]甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及甘薯病毒的RT-PCR检测，属于生物工程技术领域，特别是涉及一种危险性甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法。

背景技术：

甘薯病毒病害（Sweet potato virus diseases，SPVD)是由甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）协生共侵染甘薯引起的病毒病害。SPVD是上世纪70年代首先在非洲发现，目前主要分布在非洲和南美的一些国家。感染SPVD的甘薯表现为植株矮化、叶片褪绿、扭曲变形、脉明等症状。该病对甘薯产量影响极大，在非洲，病害严重时可造成减产80%以上，甚至绝收，SPVD是甘薯上最危险的病害之一。目前，发明人已在我国的广东、四川、江苏等地首次检测到SPVD的存在，为了加强对该病的预警和控制，防止该病的进一步蔓延危害，必须建立快速、高效的检测技术。

目前用于甘薯病毒检测的常用方法是酶联免疫吸附（ELISA）技术和PCR技术，由于ELISA技术的灵敏度较低，而且需要分别检测SPCSV 和SPFMV才能确定SPVD是否存在。另外SPFMV在中国至少存在CH和CH2两个株系类型，由于SPCSV与SPFMV不同的株系类型互作可能引起不同的产量损失，利用ELISA方法还不能有效区分SPFMV不同株系。而利用单一的RT-PCR进行检测时，也需要分别对SPCSV 和SPFMV进行检测才能确定SPVD是否存在，工作量大，效率低。 

发明内容：

本发明要解决的技术问题：克服现有的甘薯病毒检测的缺点，提供一种在一次PCR反应中检测危险性甘薯病毒病害SPVD是否存在以及存在类型的方法，为甘薯病毒的特异性检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。

本发明的技术方案是：

甘薯病毒病害SPVD的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）分别合成甘薯褪绿矮化病毒的引物CSV 1和CSV 2；甘薯羽状斑驳病毒的引物FMV 1和FMV 2；甘薯羽状斑驳病毒CH株系的上游引物FMVCH，甘薯羽状斑驳病毒CH2株系的上游引物FMVCH2，所述引物序列为：

CSV 1：5＇-AGTGGTGAYGTAATAGTCGGTGG-3＇，                                    

CSV 2：5＇-GCTAACGATTCACADACAGACTTCA-3＇，

FMV 1：5＇-GARCARTTYCRMGCATGGTATGA-3＇，

FMV 2：5＇-GAAGTGYGTCATRATYTGCCTAA-3＇，

FMVCH：5＇-GCGTGATACGAGCAAAGAAAAGG-3＇，

FMVCH2：5＇- CCAAAAGGGGCATTTACAGCACC-3＇，

其中Y为C或T，D为G、A或T，R为A或G，M为A或C；

（2）提取感染SPVD的甘薯叶片的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

 （3）将所述CSV 1、CSV 2、FMV 1、FMV 2、FMVCH和FMVCH2引物置于PCR反应体系中，以反转录产物作为模板，进行PCR扩增；

（4）用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

所述反转录时的反应体系为10μl，包括：2μl 5×RT buffer，1μl 浓度为25mmol/L的MgCl₂，1μl浓度各为10mmol/L的 dNTP混合物，CSV 2引物0.5μl，FMV 2引物0.5μl，0.25μl浓度为40U/μl的抑制剂，0.5μl浓度为5U/μl的反转录酶，4.25μl 甘薯叶片的总RNA；所述CSV 2、FMV 2引物浓度均为10μmol/L。