[发明专利]一种冻存细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改进的冻存细胞的方法，属生物技术领域。

背景技术

随着生物学技术的发展，细胞体外培养被广泛应用到各种生物学研究领域，在体外细胞培养工作中，为了保存细胞，并使其长期具有生物活性，细胞的冻存与复苏成为至关重要的环节。对于体外培养的细胞，必须能够以较高的效率实现冻存与复苏，才能达到生物学对细胞的要求。因此探讨供体细胞有效的冻存方法是很必要的。

细胞冻存与复苏的基本原则是“慢冻速溶”，这样可以最大限度的保持细胞活性。细胞冻存过程中，降温的速度，直接关系到冻存效果，“缓慢冰冻”是保护细胞使之不发生严重损伤的关键因素。

细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-5℃时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-15℃之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态，细胞内未结冰的水分子会比细胞外结冰的水分子具有更高的化学能，其结果是，细胞内水分子为了与细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰。

不同的冷冻速度能使细胞内发生不同的生理变化，也能对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性，同时还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成冰晶，造成细胞膜及细胞器的损坏，产生细胞内冰晶损伤。

科学合理的控制降温速度，是细胞冻存成功的关键。根据控制降温速度方法的不同，目前常用的细胞冻存方法有两种：1、传统的逐级降温法，即利用各种温级的低温设备逐级降温至-70℃～-80℃，然后直接投入液氮进行保存；2、程控降温仪降温法，冻存细胞按照设定的降温速度从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮进行保存。应用程控降温仪可以准确控制细胞冻存的降温速度，效果较好；但程控降温仪价格昂贵，使用成本太高，仅少数部门能够使用。目前国内外学者多采用逐级降温法进行细胞冻存，相比程控降温仪成本低了很多，更经济实用。

传统的逐级降温法的操作程序为：活性细胞悬液→4℃、0.5～1小时→-20℃、0.5～2小时→-80℃、8～16小时→浸入液态氮（-196℃）。本方法用到了4℃、-20℃、-80℃、液氮容器四种不同的低温设备，分阶段的低温环境延缓了细胞降温速度，符合“缓慢冰冻”原理。但是这种逐级降温细胞冻存着历经四步降温，程序复杂、操作繁琐，设备成本高，并且细胞的复苏存活率不高，冻存半年后，一般复苏存活率均低于80%。为了简化操作程序、降低工作成本、提高冻存细胞的复苏存活率，有必要寻找一种更好的新方法或改进方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷，提供一种冻存细胞的方法，该方法具有操作程序简化、工作成本低、冻存细胞的复苏存活率高等优点。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种冻存细胞的方法，它按以下步骤操作：

a. 细胞的消化：用胰蛋白酶液消化细胞后，弃去消化液，加入含有10%小牛血清的细胞培养液，使细胞悬浮，以800-1000 r/min离心5 min，弃去上清液；

b.冻存液稀释细胞：用冻存液将细胞沉淀悬浮，调整至适合的细胞密度后分装于细胞冻存管中；

c.冷冻降温：将冻存管直立放入聚苯乙烯保温盒中，封好聚苯乙烯保温盒盖，放于-80℃低温设备中，静置12~16小时；

d. 浸入液态氮：将冻存管从聚苯乙烯保温盒中取出迅速浸入液氮（-196℃）中，长期保存。

上述冻存细胞的方法，所述胰蛋白酶液质量浓度为0.25%。

上述冻存细胞的方法，所述细胞培养液为MEM(Minimum Essential Medium)、DMEM（Dulbecco,s Modified Eagle Medium)、RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)或M199（Medium 199）。

上述冻存细胞的方法，所述冻存液由20%的胎牛血清、10%的二甲基亚砜（DMSO）和70%的细胞培养液组成。

上述冻存细胞的方法，所述细胞密度为1×106~1×107个/ml。