[发明专利]一株产新结构镇痛作用单吲哚化合物的大肠杆菌工程菌5C11及其含的深海宏基因组基因簇

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一株产新结构镇痛作用单吲哚化合物的大肠杆菌工程菌5C11及其含的深海宏基因组基因簇。

背景技术

半个世纪来，陆栖微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等生物活性物质的资源，海洋微生物也将成为21世纪开发新型的尤其是抗癌抗肿瘤药品的资源。海洋微生物特别是深海微生物由于生活在高盐、高压及寡营养的特殊环境中，具有独特的代谢方式，因此能产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物。

深海占地球表面积的49％，是地球表面最大的生物栖息场所，深海环境中微生物基因资源的开发具有现实、重要的资源及科学价值。典型深海特征为低温(＜5℃)和高压(最高达110MPa)，据估计在此极端条件下，深海环境中可培养微生物还不到0.01％。

采用宏基因组技术能部分克服传统培养方法的局限性，获得新的科学发现和基因资源。自1998年宏基因技术建立以来，该技术的应用越来越广泛，在酶的开发方面已经取得了不俗成绩。随着宏基因组学技术和谱学技术的发展和完善，基于宏基因组的药物开发亦成为可能。本专利涉及到的一个产具有新结构镇痛单吲哚化合物的深海宏基因组文库工程菌，为此类研究奠定了良好基础。为此，提出本项发明。

发明内容

本发明目的在于提供产新结构镇痛作用单吲哚化合物的大肠杆菌工程菌5C11及其含的深海宏基因组基因簇。该大肠杆菌5C11EPI3005C11(Escherichia coli EPI3005C11)菌种保藏号为CCTCC NO：M 2010243，保藏日期为2010年9月21日，保藏地点为湖北省武汉市武汉大学，保藏机构为中国典型培养物保藏中心。

本发明的另一目的在于提供该工程菌的应用，其生产一种新结构镇痛作用单吲哚化合物。

我们从太平洋深海沉积物样品进行富集，提取富集样品DNA建立Fosimid文库，质粒载体(Fosmid，插入片段40～45kb)，宿主是大肠杆菌(Escherichia coli)，获得约3000个克隆子。通过对其发酵液乙酸乙酯粗提物细胞毒活性筛选，得到一个工程菌5C11。该工程菌LB发酵液的乙酸乙酯初提物在100ug/ml浓度下对HT1080肿瘤细胞具有良好镇痛作用(83.26％)。

该插入片段全长30226个碱基对，经过分析发现，该片段包含完整的苯和甲苯降解功能基因簇。

附图说明：

图1：所表示的是工程菌5C11所产具有镇痛作用单吲哚化合物结构。

图2：所表示的工程菌5C11插入片段基因簇。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本发明工程菌的获得

本发明提供的工程菌是采用以下方法获得的：

1.深海沉积物样品的富集：取出4℃保存的深海沉积物样品10g，于人工海水放线菌富集500ml培养基中进行富集培养，培养条件为28°，200rpm，10天。

2.深海沉积物富集样品DNA提取：富集产物30ml，10000g离心15分钟，去上清，加入13.5ml DNA抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM EDTA-Na，100mM磷酸钠缓冲液，1.5M Nacl，CTAB pH 8.0)，混匀后，加溶菌酶(10mg/ml)；37度水平振荡30分钟；加入1.5ml 20％SDS，将其至于65度水浴涡中水浴2小时，同时每15-20分钟伴随着温柔的颠倒混匀；将离心管6000g离心十分钟，去上清，沉淀重复洗两次(4.5ml buffer+0.5mlSDS，65度，10min，离心6000g，10min)此步可以省略；集中三次所得到的上清，加入等体积的酚氯仿，15000g离心15min；取水相溶液到另一离心管中，再加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1小时；16000g离心20min，得到DNA粗提物；用70％乙醇洗涤，离心之后放置于操作台吹干，最后用去离子水溶解。

3.深海沉积物富集样品宏基因组文库的构建：

A.DNA剪切

提取环境样品或所富集菌体的DNA，用琼脂糖凝胶电泳进行检测

B.DNA选择

1.切下片段大约40K至45K的DNA，，在70.C溶胶10min，按1mg固体胶溶解后体积为1μl计算，加入GELase 50XBuffer，每100μl胶加入1U GELase Enzyme，45.C水浴1小时。