[发明专利]一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，尤其是利用一种晶胶吸附层析技术从蛋清中分离溶菌酶(Lysozyme)的方法。

(二)背景技术

溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁溶解酶，因能够水解某些细菌中的黏多糖而被广泛应用于食品防腐剂、生物工程和抗菌剂等方面。国外报道已经通过动物的体外细胞培养实验证实溶菌酶是一种潜在的抗癌药物。

溶菌酶广泛存在于高等动物组织及分泌物、植物和微生物体内，其中蛋清和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的重要来源。鸡蛋作为生产原料优势在于原料丰富、廉价且鸡蛋清中溶菌酶的含量最高(约3.2％-3.5％)。从蛋清中提取溶菌酶的工业化技术比较复杂，通常需要几种技术联合使用，如：重复结晶、盐析、超滤、阳离子交换层析等。结晶法是目前工艺上提取蛋清中溶菌酶的首选方法，但需要通过反复结晶精制，其过程繁琐且生产周期长。常规阳离子交换树脂吸附层析溶菌酶，因其介质孔隙尺寸在纳米级范围，传质主要通过分子扩散，吸附平衡时间长，过程成本较高。本发明所用的阳离子交换型晶胶介质层析其传质利用对流扩散，传质阻力小，实现了溶菌酶的快速高效分离。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用晶胶吸附层析技术快速高效提取溶菌酶的新方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种溶菌酶的晶胶吸附层析分离方法，包括如下步骤：

(1)用pH值6.0～10.5的缓冲溶液稀释含有溶菌酶的混合液得到上样液，以0.1～25cm/min的流速上晶胶床柱，进行吸附；

(2)以去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液为冲洗液，冲洗掉晶胶内未被吸附的杂质；

(3)用含有0.02～3M碱金属盐的pH值6.0～10.5的缓冲溶液为洗脱液，进行洗脱，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶。

在所述的晶胶吸附层析分离过程中，通常在上样前，先以pH值6.0～10.5的缓冲溶液平衡晶胶床柱。

进一步，步骤(1)所述晶胶床柱中的晶胶介质优选为阳离子交换型，其功能基团为磺酸基。所述的阳离子交换晶胶介质的基质制备方法参照文献(Yao etal.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基质孔内接枝聚合反应及所用阳离子交换功能基团的磺酸基单体参照专利(CN100413590C)。本发明对上述两篇文献做全文引用。

进一步，步骤(1)中所述的含有溶菌酶的混合液为鸡蛋清或预处理后的鸡蛋清。所述的预处理后的鸡蛋清是指先用0.1～1M的盐酸溶液将蛋清的pH调至6.0-7.0，离心后将其上清液的pH用0.1～1M的氢氧化钠溶液调至7.0～10.0范围，再次离心后的上清液。通常是将含有溶菌酶的混合液稀释2～10倍，然后低温搅拌、离心得到上清液作为上样液。

进一步，步骤(2)中所述冲洗液的流速在0.1～25cm/min。

进一步，步骤(3)中的洗脱优选梯度洗脱，洗脱液流速0.2～20cm/min，先用含碱金属盐0.02～0.15M的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，再用碱金属盐含量相应更高(0.15～3M)的pH值6.0～10.5的缓冲溶液进行洗脱，收集含溶菌酶的洗脱峰，得到所述的溶菌酶。

进一步，步骤(3)所述的碱金属盐优选NaCl或KCl。

本发明所述的pH值6.0～10.5的缓冲溶液可选自下列之一：①pH 6.0～8.0磷酸盐缓冲溶液、②pH 7.1～9.0Tris-盐酸缓冲溶液、③pH 9.1～10.5碳酸盐缓冲溶液。

本发明在步骤(3)洗脱完毕后，依次用0.1M HCl、1～2M NaCl和去离子水对使用过的晶胶床柱进行再生。

本发明具体推荐所述方法按照如下步骤进行：

(a)以pH值6.0～10.5的缓冲溶液平衡晶胶床柱；所述晶胶床柱中的晶胶介质为阳离子交换型，其功能基团为磺酸基；

(b)用pH值6.0～10.5的缓冲溶液稀释鸡蛋清或预处理后的鸡蛋清得到上样液，以0.1～25cm/min的流速上晶胶床柱，进行吸附；

(c)以去离子水或pH值6.0～10.5的缓冲溶液为冲洗液，以0.1～25cm/min的流速冲洗掉晶胶内未被吸附的杂质；