[发明专利]一株木霉K9301菌株及其在制备木霉蛋白酶中的应用

权利要求书

1.一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，2010年9月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2010223。

2.权利要求1所述的木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株在制备木霉蛋白酶中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)将菌种保藏号为：CCTCC NO：M2010223的木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)经活化培养基活化后，接种至液体培养基进行培养，然后接种至液体发酵罐培养基发酵，制得液体菌种；

(2)按每百重量份浅层固体发酵培养基接种6～8重量份经步骤(1)制得的液体菌种，在25～28℃，空气相对湿度80～85％的条件下，浅层固体发酵3～4天，发酵期间每隔20～30小时翻曲一次，制得木霉蛋白酶发酵培养物；

(3)将步骤(2)制得的木霉蛋白酶发酵培养物按1∶(5～8)的重量比加水浸泡11～12小时，板框过滤，过滤液即为蛋白酶的提取液；

(4)将步骤(3)制得的蛋白酶的提取液经浓缩后，加入稳定剂，即得。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中的活化培养基的制备方法及活化条件如下：

活化培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与4～6重量份的水混合，78～82℃浸泡1小时或煮沸半小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1～2份，琼脂1.5～2份，自然pH值，8磅灭菌，即得活化培养基；

活化条件：划线接种木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，28～30℃活化25～35h，经与无菌水混合后得菌悬液。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中的液体培养基的制备方法及培养条件如下：

液体培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与3～6重量份的水混合，78～82℃浸泡1小时或煮沸半小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1～2份，自然pH值，8磅灭菌，即得液体培养基；

培养条件：按3～5％重量百分比的接种量接种经活化后的菌悬液，28～30℃摇床培养25～35h，得菌液。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中的液体发酵罐培养基的制备方法及发酵条件如下：

液体发酵罐培养基的制备方法：将麸皮10～15重量份与水100重量份，混合，煮沸半小时后，过滤，再加入蛋白胨0.5～0.6重量份、Na₂HPO₄ 0.3～0.5重量份、KH₂PO₄ 0.04～0.05重量份，混匀后灭菌，即得液体发酵罐培养基；

发酵条件：按每百重量份液体发酵罐培养基接种6～8重量份经培养后的菌液，28～30℃通风搅拌，发酵30～36小时，得液体菌种。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中的浅层固体发酵培养基按如下步骤制得：

将玉米秸粉或小麦秸粉30～40重量份，麸皮30～40重量份，豆粕20～30重量份，硫酸铵0.5～1.0重量份，混合后，制得原料；然后按原料∶水＝1∶4(重量比)混合，灭菌，冷却后，即得。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)制得的蛋白酶发酵培养物活性为500～700U/g干曲。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中的浓缩，步骤如下：

将步骤(3)制得的蛋白酶的提取液用截留分子量为5000Da的超滤膜浓缩，浓缩至原来体积的1/10～1/5，制得高活性液体木霉蛋白酶，其蛋白酶活性为1000～1500U/ml；然后，在高活性液体木霉蛋白酶中加入1～2％(重量百分比)的稳定剂。

10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中的稳定剂为海藻糖。