[发明专利]一株木霉K9301菌株及其在制备木霉蛋白酶中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株及其在制备木霉蛋白酶中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

木霉是一类典型的生物防治菌株。木霉属中许多种类比如哈茨木霉、绿色木霉、康宁木霉都已被开发成为生防制剂。木霉对于病原真菌的拮抗作用是通过分泌细胞壁降解酶，产生抗生肽，诱导植物抗性，争夺营养与空间以及重寄生作用等机制协同实现的。木霉产的蛋白酶是一种细胞壁降解酶，它可以降解病原真菌细胞壁中的蛋白成分，并且失活病原真菌分泌的重要酶类，从而在木霉抗真菌过程中发挥作用。有报道从哈茨木霉中分离的蛋白酶抑制Botrystiscinerea的菌丝生长及孢子萌发，另外许多高产蛋白酶的木霉突变体的拮抗效果明显提高。

蛋白酶是一大类可以降解蛋白质的水解酶类，根据催化结构域中功能基团的不同，它可以分为丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶四大类。根据作用最适pH值的不同可以分成酸性蛋白酶，中性蛋白酶和碱性蛋白酶。碱性蛋白酶在洗涤等工业领域得到了广泛应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株及采用该菌株并利用浅层固体发酵技术制备具有抑制植物病原真菌功能的木霉蛋白酶的方法。

一株木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，2010年9月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：M2010223，地址：中国，武汉，武汉大学。

木霉K9301菌株，能够在以纤维素、半纤维素为碳源、以硫酸铵、豆粕为氮源的培养基中快速生长，并且该木霉菌株高产蛋白酶，该蛋白酶可抑制植物病原真菌的生长，在植物真菌病害的防治中具有很好的应用潜力。

上述木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株在制备木霉蛋白酶中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)将菌种保藏号为：CCTCC NO：M2010223的木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)经活化培养基活化后，接种至液体培养基进行培养，然后接种至液体发酵罐培养基发酵，制得液体菌种；

(2)按每百重量份浅层固体发酵培养基接种6～8重量份经步骤(1)制得的液体菌种，在25～28℃，空气相对湿度80～85％的条件下，浅层固体发酵3～4天，发酵期间每隔20～30小时翻曲一次，制得木霉蛋白酶发酵培养物；

(3)将步骤(2)制得的木霉蛋白酶发酵培养物按1∶(5～8)的重量比加水浸泡11～12小时，板框过滤，过滤液即为蛋白酶的提取液；

(4)将步骤(3)制得的蛋白酶的提取液经浓缩后，加入稳定剂，即得。

步骤(1)中的活化培养基、液体培养基、液体发酵罐培养基成分及活化、培养、发酵条件均可采用本领域常用技术，优选方案如下：

活化培养基的制备方法及活化条件如下：

活化培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与4～6重量份的水混合，78～82℃浸泡1小时或煮沸半小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1～2份，琼脂1.5～2份，自然pH值，8磅灭菌，即得活化培养基；

活化条件：划线接种木霉K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，28～30℃活化25～35h，经与无菌水混合后得菌悬液。

液体培养基的制备方法及培养条件如下：

液体培养基的制备方法：将处理后的土豆块按每重量份与3～6重量份的水混合，78～82℃浸泡1小时或煮沸半小时，过滤后，滤液加水稀释至原来的体积；再加葡萄糖1～2份，自然pH值，8磅灭菌，即得液体培养基；

培养条件：按3～5％重量百分比的接种量接种经活化后的菌悬液，28～30℃摇床培养25～35h，得菌液。

液体发酵罐培养基的制备方法及发酵条件如下：

液体发酵罐培养基的制备方法：将麸皮10～15重量份与水100重量份，混合，煮沸半小时后，过滤，再加入蛋白胨0.5～0.6重量份、Na₂HPO₄ 0.3～0.5重量份、KH₂PO₄ 0.04～0.05重量份，混匀后灭菌，即得液体发酵罐培养基；

发酵条件：按每百重量份液体发酵罐培养基接种6～8重量份经培养后的菌液，28～30℃通风搅拌，发酵30～36小时，得液体菌种。

所述步骤(2)中的浅层固体发酵培养基按如下步骤制得：