[发明专利]一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程领域，具体地，涉及一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒、该试剂盒的应用以及一种快速分离骨髓间充质干细胞的方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞等多种组织细胞，在临床上应用于组织工程、基因治疗、细胞因子替代治疗等领域。然而，骨髓间充质干细胞仅占骨髓内成核细胞总数的0.001％～0.01％，并且随着年龄的增长而减少。应用骨髓间充质干细胞进行进一步实验的前提条件是快速实现骨髓间充质干细胞的扩增分离。

目前，对骨髓间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准。现阶段用于骨髓间充质干细胞的分离培养方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞术法和免疫磁珠法。密度梯度离心法主要根据细胞不同密度来分离细胞群落。流式细胞术法和免疫磁珠法利用骨髓间充质干细胞对一定数目抗体的反应性从而通过表达抗体的阳性选择来获得。贴壁筛选法是最早也是最简单的分离方法，但存在纯度低、培养时间长等缺点。以前的研究对贴壁筛选法进行了深入的探讨，其中包括采用不同的培养液，选择不同的换液方式等。然而现有的实验仍然存在一定的不足，例如培养液的配制过于复杂、原代培养时间仍然过长、细胞的纯度不高等。

发明内容

为了解决骨髓间充质干细胞分离的纯度、数量和时间问题，本发明提供了一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒。利用此试剂盒，能有效纯化哺乳动物骨髓间充质干细胞，快速获得大量骨髓间充质干细胞，以利于进行下一步的实验研究。

根据本发明的一个方面，本发明的快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒包括洗涤液，细胞培养液A，细胞培养液B和细胞消化液，其中：

所述洗涤液为磷酸盐缓冲液溶液；

所述细胞培养液A为α-MEM液体培养基；

所述细胞培养液B为胎牛血清；

所述细胞消化液为胰蛋白酶液。

根据本发明的一个方面，所述骨髓间充质干细胞源自哺乳动物。

根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液是无菌的。

根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液为独立包装。

根据本发明的一个方面，用于骨髓间充质干细胞的培养的细胞培养液是将细胞培养液A与细胞培养液B按照9∶1体积比配制的细胞培养混合液。

根据本发明的一个方面，所述磷酸盐缓冲液可为0.01M，所述细胞消化液可为质量/体积百分比浓度为0.25％。

本发明的另一目的在于提供了一种快速分离骨髓间充质干细胞的方法。该方法用洗涤液冲洗骨髓腔得到细胞，经原代培养，传代培养最终获得分离的骨髓间充质干细胞。

根据本发明的一个方面，所述快速分离骨髓间充质干细胞的方法可通过下述步骤实现的：将得到的细胞在细胞培养混合液中贴壁培养，培养24小时后半量更换细胞培养混合液，培养获得原代培养的骨髓间充质干细胞；利用洗涤液冲洗获得的骨髓间充质干细胞，随后用细胞消化液对其进行消化，经细胞混合液传代培养至细胞密度达到90％；以及再次利用细胞消化液对经传代培养的骨髓间充质干细胞进行消化，获得分离的骨髓间充质干细胞。

本发明的方法采用培养24小时首次半量换液方法，利用存在于原培养液中造血干细胞的旁分泌作用，既部分地清除了大量未贴壁的造血系细胞，又保证了骨髓中其他细胞分泌的细胞因子对骨髓间充质干细胞的滋养作用，从而确保了细胞培养和传代过程中的生长和纯化效果。

根据本发明的一个方面，所述快速分离骨髓间充质干细胞的方法可包括：

1、骨髓间充质干细胞的原代分离培养：

利用洗涤液将细胞从骨髓腔内冲出，收集、离心、弃去上悬液，用细胞培养混合液充分吹打成单细胞悬液，接种培养。接种24小时后，半量换液，继续培养，以后每3天更换一次细胞培养混合液。7天即可完成原代培养。

2、骨髓间充质干细胞的传代培养：

弃除原代培养的培养混合液，用洗涤液充分清洗细胞，去除悬浮在贴壁细胞表面的圆形细胞，加入细胞消化液，待细胞回缩、细胞间隙增大时，加入细胞培养混合液，充分吹打、离心、弃上清液、加入细胞培养混合液、接种、培养。

3、骨髓间充质干细胞的收获：

细胞密度达到90％，弃去原培养液，加入细胞消化液进行消化，收获培养的骨髓内的间充质干细胞。

附图说明

图1是原代骨髓间充质干细胞培养7天后的细胞观察图；

图2是原代骨髓间充质干细胞传代培养后的细胞形态观察图；和