[发明专利]检测大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种检测大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记的试剂盒。

背景技术

骨髓间充质干细胞(MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞等多种组织细胞，在临床上应用于组织工程、基因治疗、细胞因子替代治疗等领域。

骨髓间充质干细胞是一群具有独特表型的细胞，国际间充质及组织干细胞委员会于2006年对人来源MSCs实验研究提出了三条最低鉴定标准，其中表面分子检测是其中一项非常重要的指标。表面分子数目众多，而不同种类哺乳动物骨髓间充质干细胞的表面分子也不尽相同，例如人骨髓间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞，因而需要选择适当的表面分子对不同物种进行骨髓间充质干细胞的鉴定。

发明内容

本发明提供了一种检测大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记的试剂盒，以表征大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记特征。利用此试剂盒，能有效地检测大鼠骨髓间充质细胞的表面分子标记，如：β-actin、细胞特异性抗原标记SH2、造血干细胞标记CD34、细胞表面黏附分子标记CD44和CD31等表达的特征。

根据本发明的一个方面，检测大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记的试剂盒包括具有下面SEQ ID No.1-SEQ ID No.10所示序列的表面分子的上、下游引物：

SEQ ID No.1：5′-CTGTCACCTTCACCGTTCC-3′；

SEQ ID No.2：5′-CATCGTCCACCGCAAAT-3′；

SEQ ID No.3：5′-TCTCCCCTAGTTCTGCCTCCATTG-3′；

SEQ ID No.4：5′-CGCCCCCGACGCCTCTTCT-3′；

SEQ ID No.5：5′-TTGGCATCCCTCCTGGCGCTGG-3′；

SEQ ID No.6：5′-AAGGAGGAACTGGAAGAGACCC-3′；

SEQ ID No.7：5′-GCCCAGTCTGAGGTTAGGCC-3′；

SEQ ID No.8：5′-ATTGGCCTTTCCCTGAGTCT-3′；

SEQ ID No.9：5′-GCCCTGTCACGTTTCAGTTT-3′；和

SEQ ID No.10：5′-CTGCAATGAGCCCTTTCAGTTT-3′，

其中SEQ ID No.1-2是用于β-actin的引物，SEQ ID No.3-4是用于SH2的引物，SEQ ID No.5-6是用于CH44的引物，SEQ ID No.7-8是用于CD34的引物，SEQ ID No.9-10是用于CD31的引物。

根据本发明的一个方面，检测大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记的试剂盒可进一步包括：总RNA提取液，其包括Trizol溶液、氯仿溶液、异丙醇溶液、75％乙醇溶液、焦碳酸二乙酯处理的灭菌双蒸去离子水；反转录公共混合液；随机引物；dNTP混合液；聚合酶链式反应(PCR)反应公共液。

本发明的又一目的在于提供一种进行检测大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记的方法，包括：

1、获得骨髓间充质干细胞；

2、培养第三代大鼠骨髓间充质干细胞，获得RNA；

3、RT-PCR合成cDNA；

4、利用包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.10的序列、以及上步合成的cDNA的反应体系进行PCR反应；

5、电泳检测PCR反应产物并观察。

根据本发明的一个方面，可利用24小时半量换液法获得骨髓间充质干细胞。

可以利用本发明的试剂盒，对大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记进行鉴定，从而有效证实所培养细胞为大鼠骨髓间充质干细胞。

附图说明

图1：大鼠骨髓间充质干细胞反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)产物的电泳结果：M：DNA分子量标准(DL-2000Marker)；1：空白对照；2：β-actin；3：SH2；4：CD44；5：CD34；6：CD31。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但是并不以此来限制本发明。

实施例1、用于检测大鼠骨髓间充质干细胞表面分子标记的试剂配制

1、RNA提取试剂：包括Trizol溶液、氯仿溶液、异丙醇溶液、75％乙醇溶液、经焦碳酸二乙酯溶液(DEPC)处理的无RNA酶的水。