[发明专利]一种利用高效液相离子交换色谱测定低聚木糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低聚木糖的测定方法，特别涉及一种利用高效液相离子交换色谱测定低聚木糖的方法。

背景技术

低聚木糖是一类聚合度为2～8的β-1,4-木糖苷键连接而成的低聚糖的总称，作为一种新型功能性的低聚糖，低聚木糖是一种高效的人体和动物的双歧因子和免疫增强剂，具有良好的调节肠道微生态和激活机体免疫功能等多种保健促生功能，可广泛应用于医药、食品、饮料和饲料等行业。

低聚木糖的制备方法主要有木聚糖定向酶降解、蒸汽爆破等方法，所得到的产品中均为包括一系列聚合度不同的各种低聚木糖组分的混合物。目前，低聚木糖的糖组分分析和含量测定主要采用下述几种方法：

（1）将低聚木糖经强酸加热水解后生成木糖，再以显色剂或高效液相色谱仪测木糖量，然后换算成低聚木糖，所采用的色谱柱主要有Nova-Pak 250×3.9（4μm）（见CN100422736C）、Bio-Rad Aminex HPX-87H （见GB/T23747-2009）或HPX-87P等；

（2）采用活性炭柱层析、硅胶薄层析（见CN101632877A）或高效液相色谱法分离和测定低聚木糖中各种糖组分，主要采用的色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-42A；

（3）采用气质联动法测定。

其中，高效液相色谱法是当前低聚木糖产品分析和检测应用较为广泛的一种方法。

方法（1）采用强酸加热水解法将所有的低聚木糖均水解成木糖，无法区分和定量测定不同代聚木糖组分；方法（2）由于低聚木糖的各种糖组分的分子结构相近、分子量差异较小，现有的薄层析和高效液相色谱法都难以实现聚合度相邻的低聚木糖组分的直接有效分离，也难以对不同低聚木糖组分进行定量测定；方法（3）的需要对糖进行衍生化处理，操作复杂，测试成本较高。同时，由于缺乏木七糖等聚合度更高的低聚木糖标准样品，对产品中这些低聚木糖组分定性和定量分析较为困难。上述各种低聚木糖的测定方法均存在着操作步骤繁琐、糖组分的分离度不高、结果重现性差或检测成本昂贵等不足； 

因此，研究和开发一种准确和快速的低聚木糖的定性分析和定量测定方法，对于该类产品的检验评价和推广应用具有重要的意义。

发明内容

发明目的：针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种高效液相离子交换色谱定性分析和定量测定低聚木糖的方法，以实现对低聚木糖样品，尤其是木糖至木八糖类糖组分的快速高效定性分析和精确定量检测。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用高效液相离子交换色谱测定低聚木糖的方法，包括以下步骤：

（1）高效液相离子交换色谱系统与色谱条件：

美国Dionex ICS-3000 离子色谱系统，采用CarboPacTM PA200（3×250m）色谱柱带保护柱（3×50mm），柱温30℃，自动上样，进样体积10.0μL；以500mmol/L醋酸钠和100mmol/L氢氧化钠为淋洗液进行二元梯度淋洗，流速为0.3mL/min，在0～40min内醋酸钠溶液淋洗的浓度梯度为0～120mmol/L；电化学检测器检测模式为金工作电极和pH-Ag/AgCl复合型参比电极，采用积分脉冲安培检测法和色谱峰面积积分法测定糖组分的含量；

（2）低聚木糖标准工作方程的测定：

将木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖标准品配制成0.5～10 mg/L的标准溶液，采用步骤（1）中的色谱条件测定木糖至木六糖的标准工作方程和RT；

（3）木七糖和木八糖的色谱保留时间的确定：

以木糖至木六糖的NDP与步骤（2）测定的RT，进行线性回归计算出RT与NDP之间的线性关系式为：RT（min）=2.5785×NDP+1.9726，相关系数R²=0.9952；由该线性关系式计算出木七糖和木八糖的色谱保留时间； 

（4）低聚木糖成分的分析与测定：

将低聚木糖待测样品充分溶解于25～30℃的蒸馏水中，定容并调节待测低聚木糖组分的浓度1.0～8.0mg/L，在10000rpm条件下离心5min后以0.2μm微滤膜过滤上清液得样品液，采用步骤（1）中的色谱条件进行色谱检测；采用步骤（2）和（3）进行木二糖至木六糖的定量测定，及木七糖和木八糖的定性分析。

步骤（2）中，所述的标准工作方程为：

木糖A=3.5218c₁－0.0193；

木二糖A=3.0798c₂－0.1026；