[发明专利]一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶纯化和固定化领域，具体涉及一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法。

背景技术

亚油酸异构酶通常用于将亚油酸转化为共轭亚油酸，而共轭亚油酸具有许多重要生理作用：抗癌；抗氧化；降低胆固醇；抑制脂肪积累；防治糖尿病；抗粥状动脉硬化；改善骨组织代谢等作用；目前，人体必需脂肪酸共轭亚油酸在医药保健、食品、饲料等方面的应用潜力受到越来越多的关注。   

目前共轭亚油酸生产主要采用化学法，如亚油酸的碱法异构化，但化学法得到的产物为一系列具有共轭双键的所有位置和几何异构体的CLA混合物，同时还有副产物存在，而要分离获得单一异构体非常困难；故生物法尤其是酶法合成共轭亚油酸受到了越来越多的关注，酶法生产目前大多采用游离亚油酸异构酶，但游离酶性质不稳定，反应后游离酶难以回收再利用，不利于产品的后续分离纯化且获得游离酶的纯化步骤多，收率较低。孙琪所述东北林业大学硕士论文乳杆菌亚油酸异构酶转化沙棘共轭亚油酸工艺的研究一文报道了乳酸杆菌的亚油酸异构酶的固定化工艺研究，该工艺可制备固定化亚油酸异构酶，但是其首先要对发酵液进行离心，收集菌体，超声结合溶菌酶破壁后二次超声处理，Tritron-100提取，离心，硫酸铵分级盐析、酶液透析、浓缩等多步分离手段获得粗酶液，再采用海藻酸钠-氯化钙包埋法固定，该方法的特点是先初步纯化酶液、再应用载体进行固定化，而分步实施具有成本高、能耗大、操作繁琐、步骤多等诸多缺点。专利申请号为200610039833.4的专利公开了一种固定化脂肪酶凹凸棒土的制备方法，该专利以纯化过的商品脂肪纯酶制成酶液，然后采用的是适合脂肪酶固定化的凹凸棒土改性方法，该方法的缺点是必须首先得到纯酶，然后才能固定化。

发明内容

本发明的目的是：提供一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法，应用改性凹凸棒土作为原料和载体，操作简便，成本低廉，同时纯化和固定化。

本发明的技术解决方案是该纯化和固定化方法包括以下步骤：

(1) 按安徽农业科学2010年 15期所述文章“德氏乳杆菌保加利亚亚种产亚油酸异构酶研究制备”的记载制备亚油酸异构酶发酵液，8000rpm离心10min，收集菌体，按发酵液：缓冲液为5:2的体积比将菌体悬浮于0.1mol/L pH=6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中得缓冲液，同时添加质量占缓冲液体积0.5%的溶菌酶及质量占缓冲液体积0.2%的蜗牛酶，搅拌60min，离心10min，得上清粗酶液，在粗酶液中添加质量占缓冲液体积0.02%的阳离子聚丙烯酰胺絮凝剂，搅拌10-15min，过滤，收集滤液；

(2)按滤液与改性凹凸棒土以质量比4:1比例向依据步骤1获得的滤液中加入改性凹凸棒土，室温搅拌10-15h，真空过滤，得纯化和固定化亚油酸异构酶。

其中，所述改性凹凸棒土的制备包括以下步骤：将一定量的凹凸棒土加入到带有搅拌和冷凝装置的三颈瓶中，按1:12的质量/体积比加入2mol/L的盐酸，搅拌回流1-3h，用3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH3.5，搅拌均匀，过滤，干燥，得酸改性凹凸棒土；将酸改性凹凸棒土按1:1的质量体积比加入2mol/L的硫酸镁溶液，室温搅拌3h，过滤，干燥，得硫酸镁处理凹凸棒土；硫酸镁处理凹凸棒土中按 1:1:1:2-3的质量比加入γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅、水、二甲苯，充分搅拌混合24-30h，过滤，水洗，干燥，得改性凹凸棒土。

其中，所述阳离子型聚丙烯酰胺絮凝剂的分子量600万-800万。

本发明的有益效果是：

1.纯化和固定化亚油酸异构酶的原料是改性凹凸棒土，而我国凹凸棒土资源丰富，利用凹凸棒土作为原料，不仅成本低廉，而且扩大了凹凸棒土的应用范围。

2.本发明提供的亚油酸异构酶的纯化和固定化仅需一步，省去了多步，不仅降低了生产成本，更有效缩短了步骤和时间，并且该方法稳定可靠，易于大规模生产。

3.采用分子量为600万-800万阳离子型聚丙烯酰胺絮凝剂处理发酵液，不仅可除去菌体，还可除去大部分的杂蛋白和离子，同时省去离心、层析等多步操作，大大降低了生产成本和能耗。

4.本发明方法操作简便可靠，条件温和，固定化效率高，且省却了游离酶的纯化过程，大大降低了生产成本。

5.本发明将酶的纯化过程和固定化过程有机结合起来，在固定化的同时实现酶的高效纯化，在纯化的同时实现酶的固定化，将多步反应集成在一步反应中，实现了酶的廉价高效生产，属于原创性工作。