[发明专利]同时制备异戊酰螺旋霉素Ⅱ和Ⅲ的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素II的方法，具体地说，涉及一种采用高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)由必特螺旋霉素(Bitespiramycin)原料中同时分离制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法。

背景技术

必特螺旋霉素(Bitespiramycin)是由转基因的螺旋霉素(Spiramycin，SPM)产生菌发酵得到的一种主要组分为异戊酰螺旋霉素I、II、III的多组分全新型抗生素，其结构见如式1所示：

式1中，R＝H(异戊酰螺旋霉素I)，R＝COCH₃(异戊酰螺旋霉素II)，R＝COCH₂CH₃(异戊酰螺旋霉素III)。

由于4″位上异戊酰基侧链的存在，使得异戊酰螺旋霉素具有了与螺旋霉素(SPM)不同的理化性质，并且具有了更好的体内抗菌活性。获得必特螺旋霉素的主要活性组分，即异戊酰螺旋霉素I、II、III的高纯度样品对于深入必特螺旋霉素这一全新抗生素的药理学研究和严格其生产质量控制具有重要意义。

高速逆流色谱是一种基于液-液分配原理的新型分离技术，可以提供相当于上千理论塔板数的分离效果，为具有复杂组分、且组分间分子结构差异很小的必特螺旋霉素的主要组分的分离提供了手段。

近年来，有关采用高速逆流色谱(HSCCC)技术分离大环内酯类抗生素组分的研究主要集中于红霉素组分、螺旋霉素组分、他克莫斯和子囊霉素等组分的分离研究。例如，Hisao Oka等利用高速逆流色谱分离螺旋霉素组分，所用体系为正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(体积比)＝3∶6∶5∶5，得到的螺旋霉素I、II、III纯度分别98.2％、92.3％、97.4％(Hisao Oka，Ken-ichiHarada，Masanao Suzuki，et al.Separation of spiramycin components using high-speedcounter-current chromatography Journal of Chromatography A.2000，903：93-98)。其中，特定的溶剂系统及其溶剂配比是获得良好分离效果的关键之一。

目前尚未见采用高速逆流色谱分离制备高纯度必特螺旋霉素的主要组分的研究报道，国内外也尚未有高纯度的异戊酰螺旋霉素II和III的样品提供。酰化螺旋霉素虽然与螺旋霉素具有相似的母核，但不同的侧链基团使它们具有不同的理化性质，尤其是异戊酰螺旋霉素的C5侧链基团对其影响很大，可以作为分离螺旋霉素和异戊酰螺旋霉素的依据。但同时，螺旋霉素的分离方法也不能直接适用于异戊酰螺旋霉素中不同组分的分离。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法，填补现有技术中的空白。

本发明所提供的同时制备高纯度异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III的方法，其主要步骤是：以必特螺旋霉素(Bitespiramycin)为原料，采用高速逆流色谱(HSCCC)法从必特螺旋霉素中同时分离得到纯度大于90％异戊酰螺旋霉素II和纯度大于96％异戊酰螺旋霉素III样品；

其中，构成高速逆流色谱(HSCCC)的固定相和流动相的溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水组成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇和水的体积比为：(1.4～2.0)∶(0.1～0.4)∶1.0∶(0.8～1.7)。整个分离过程在常压和20～25℃条件下进行。

具体包括如下步骤：

(1)按上述比例配制溶剂体系构成固定相和流动相；

(2)将固定相泵入高速逆流色谱仪(HSCCC)内直至充满螺旋管；

(3)开启主机使螺旋管高速转动，同时泵入流动相；

(4)待螺旋管内建立动态平衡后，将必特螺旋霉素注入分离体系中；

(5)根据检测器谱图收集流出液，浓缩、干燥或冻干后获得异戊酰螺旋霉素II和异戊酰螺旋霉素III；

其中所说的检测器是紫外检测器或蒸发光散射检测器，样品的干燥温度不高于50℃。